[发明专利]高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用

权利要求书

1.一种重组菌，是在大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BW25113中导入重组质粒pBAD-SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD-SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述超氧化物歧化酶为序列表序列1所示蛋白。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述超氧化物歧化酶编码基因为序列表序列2所示基因。

4.根据权利要求1—3中任一所述重组菌，其特征在于：所述重组菌为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7934的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BW-pBAD-SOD。

5.权利要求1—4中任一所述重组菌在生产超氧化物歧化酶中的应用。

6.一种生产超氧化物歧化酶的方法，包括如下步骤：

将权利要求1—4中任一所述重组菌进行液体发酵，得到所述超氧化物歧化酶；

所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行：

1）将所述重组菌接种至发酵培养基中,获得初始发酵体系；

2）将所述初始发酵体系于30—37℃条件下搅拌培养至发酵液中菌体OD600值为40—45；

3）向发酵液中加入L-阿拉伯糖，于28—30℃条件下搅拌培养；

所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：葡萄糖10—20g/L,(NH₄)₂HPO₄4—8g/L,KH₂PO₄13—13.3g/L,MgSO₄0.59—1.2g/L,柠檬酸1.7—2.0g/L,FeSO₄54.67—109.35mg/L,ZnSO₄10.22—11.5mg/L,CuSO₄3.2—6.4mg/L,MnSO₄3.2—5.4mg/L,Na₂B₄O₇0.8—1.22mg/L,CaCl₂10—13.66mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄0.5—1mg/L；

所述发酵培养基的pH值为6.8—7.0。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述加入按每升所述发酵液中加入终浓度为1—2g/L的所述L-阿拉伯糖进行。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤2）中的所述培养包括在发酵液中的葡萄糖耗尽时，向所述发酵液中按200—250mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；

步骤3）中的所述培养包括向所述发酵液中按300—500mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；

所述补料培养基的溶剂为水，溶质及其在所述补料培养基中的终浓度分别为：葡萄糖600—800g/L,MgSO₄7.3—9.73g/L,FeSO₄109.4—218.8/L,ZnSO₄20.44—25mg/L,CuSO₄6.4—12.8mg/L,MnSO₄6.3—10.8mg/L,Na₂B₄O₇1.6—2.4mg/L,CaCl₂20—30.2mg/L,(NH₄)₆MO₇O₂₄1—2mg/L；所述补料培养基的pH为6.8—7.0。

9.根据权利要求6—8中任一所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述培养的时间为6—8小时；

步骤1）所述初始发酵体系中菌体的OD₆₀₀值为1.3—1.5。

10.根据权利要求6—9中任一所述的方法，其特征在于：

步骤1）所述接种是通过将含有所述重组菌的种子液按照1:（9—19）的体积比接种至所述发酵培养基中实现；

所述含有所述重组菌的种子液是将所述重组菌用如下种子培养基振荡培养制备得到的：溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：蛋白胨10—16g/L,酵母膏5—10g/L,氯化钠5—10g/L,所述种子培养基的pH为6.8—7.0。