[发明专利]犬细小病毒病毒样颗粒的制备及用途

说明书

技术领域

 本发明涉及一种病毒的病毒样颗粒，这种病毒颗粒的制备方法及用途，确切讲本发明是一种犬细小病毒病毒样颗粒，以及其制备方法及用途。

背景技术

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）是引起犬出血性胃肠炎以及幼犬心肌炎的烈性传染病之一，CPV基因组编码2个阅读框架，其中ORF1由2007个碱基组成，编码参与病毒复制等功能相关的非结构蛋白NS1、NS2；ORF2由 1755个碱基组成，编码病毒主要有结构蛋白VP1、VP2，其中VP2蛋白是构成病毒衣壳的主要成分，含量约在90%以上。研究表明， VP2蛋白在病毒感染诱导的免疫反应中起重要作用。主要的抗原位点也均在VP2蛋白上，因此，VP2 已成为目前构建CPV 基因工程疫苗的首选靶基因，目前，已有文献报道犬细小病毒能在真核细胞中形成病毒样颗粒、但由于真核表达表达量低且费用高，使采用真核表达产物制备病毒样颗粒疫苗难于应用于临床。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的，用原核表达系统表达和组装得到犬细小病毒的病毒样颗粒，以及这一病毒样颗粒的制备方法及相关的用途。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒由VP2蛋白组成，其基因序列为SEQ ID №1。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法是以犬细小病毒DNA为模板，用SEQ ID №2和SEQ ID №3为引物扩增得到扩增产物，将扩增产物插入载体pSMK中，得重组质粒pSMK-VP2，将pSMK-VP2转化到大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL株，在37℃，含卡那霉素（Kanamycin ）(50μg/mL) 和氯霉素（chloramphenicol）（34μg/ml）的LB培养基中培养重组大肠杆菌，以IPTG诱导表达重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法中，对表达得到的VP2重组蛋白进行纯化的方式为亲和层析纯化，更确切讲，本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法中，是将表达菌沉淀超声裂解后的上清转移至经buffer A（500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0）平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，在室温条件下结合1h，之后用buffer A洗涤层析柱，目的蛋白用buffer B（500mM NaCl、20mM Tris-HCl、300mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0）洗脱，每次1ml，反复洗脱5-6次。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法中重组蛋白纯化后进行体外组装方法为：将重组融合VP2蛋白按质量比100:1加入sumo酶，再置于透析袋内，透析袋外部的缓冲液为150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.0，组装时整个缓冲体系置于搅拌仪上，使缓冲液轻微搅动，得到犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒可在制备用于预防犬细小病毒引起疾病的疫苗中的应用，也可以在制备用于检测犬细小病毒的检测试剂中的应用。

病毒样颗粒（VLP）是由病毒的一个或者多个结构蛋白的多个拷贝按照一定的顺序排列自我组装成形态上与真实病毒粒子相似的颗粒状物质。由于不含有病毒的遗传物质，因此没有感染性。由于病毒样颗粒可与真实病毒具有相似嗜性，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体免疫系统产生免疫保护。

多种病毒的结构蛋白能在不同的表达系统中自动组装成病毒样颗粒。病毒样颗粒作为一种新型生物学工具被引进相关生物学研究领域，如：作为生物载体携带核酸、蛋白、药物、及标记物，尤其是将病毒样颗粒作为目前最优越的候选疫苗，在动物及人类疾病预防与治疗中发挥了强大潜力。目前病毒样颗粒疫苗研究取得较大进展的病毒有：人乳头瘤病毒、人获得性免疫缺陷型病毒、流感病毒、乙肝病毒、细小病毒等。如前所述，现有技术中虽曾有以真核表达方式建立犬细小病毒病毒样颗粒的作法，但本发明可克服真核表达的不足，使可实际应用于临床的犬细小病毒病毒样颗粒成为可能。

传统的原核表达系统表达效率高，但是由于缺乏正确的修饰与折叠，多数情况下以非可溶性的包涵体形式存在。研究发现，泛素和小分子泛素样修饰蛋白能够帮助原核表达蛋白的正确折叠，提高蛋白的水溶性，这些辅助分子已经被成功地应用于毒性蛋白的表达。本发明采用了小泛素样修饰蛋白的原核表达系统，即促进了表达蛋白的正确折叠，提高了水溶性，又兼顾了原核表达系统表达效率高的优点。

附图说明