[发明专利]使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种增加牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的活性物质及方法，属于家畜胚胎工程技术领域，具体是一种使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法。 

背景技术

目前牛的冷冻精液已经进入商业化生产，被广泛应用于人工受精技术。精液生产和使用中的冷冻解冻过程破坏了精子的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在正常生理条件下的动态平衡，导致精子ROS增加，引起精子膜的流动性改变，产生氧化损伤，从而影响精子活力、质膜完整性及形态等，降低了受精能力。同时ROS会损害细胞内的脂质、核酸以及蛋白质，使有关早期胚胎发育的蛋白质没有得到表达或蛋白结构受到破坏，导致早期胚胎体外发育率较低。 

染料木黄酮(Genistein，又称染料木素)，化学名为4′，5，7-三羟异黄酮。来源于豆类植物和齿状植物的异黄酮类化合物，是大豆异黄酮的主要活性成分，也可以通过化学方式合成。染料木黄酮一方面具有抗氧化功能，可以清除活性氧减少过氧化物引起的DNA损伤。Fraser等（2006）研究表明，1-100nmol/L Genistein与人类精子共孵育，可以加快精子获能和顶体损伤；浓度为0.01-100μmol/L时，可以显著降低过氧化氢引起的DNA损伤（Sierens et al.,2002）；浓度达到500μmol/L时，会导致精子ROS含量增加，但不会影响精子生存能力同时也不会引起DNA损伤(Bennetts et al.,2008）。另一方面染料木黄酮也是一种酪氨酸蛋白激酶（TPK）抑制剂。酪氨酸蛋白磷酸化是调控精子获能、运动性能变化以及超活化的重要因素，抑制酪氨酸蛋白激酶（TPK）活性能降低 精子的运动参数，但是不同剂量的染料木黄酮对精子活力的影响不同。低剂量的染料木黄酮对鼠和人的精子活力无影响（Kumi-Diaka et al.,2001）；但是在人精液解冻时添加10μmol/L染料木黄酮，可以轻微增加直线运动的精子活率和总体的精子活率（Martinez-Soto et al.,2010）；当剂量达到400μmol/L，精子活率反而下降（Bajpai et al.,2003a;Bajpai et al.,2003b）。 

利用染料木黄酮来改善人和老鼠精子运动能力的报道较多，并且研究结果一致表明，在含有血清白蛋白的HTF受精液和胎牛血清(FCS)培养基添加10μmol/L的染料木黄酮，可以降低ROS对人精子产生的过氧化损伤，提高精子活率，但是染料木黄酮对牛精子运动性的影响尚未见到报道。虽然通过分析精子的运动能力可以预测精子的受精能力，但是每种动物的体外受精过程均不一样，影响体外受精的因素也比较多，不同动物的受精过程就会出现很大的差异，而且染料木黄酮虽然有在改善人和老鼠的运动能力报道过，但是如何使用该物质来提高精子的运动性以及能否改善体外受精后胚胎的发育情况，特别是使用该物质来提高牛冷冻精液的运动性及受精率，目前并没有相关文件对其说明。 

1Fraser LR,Beyret E,Milligan SR,Adeoya-Osiguwa SA.Effects of estrogenic xenobiotics on human and mouse spermatozoa.Hum Reprod.2006;21:1184-93. 

2Sierens J,Hartley JA,Campbell MJ,Leathem AJ,Woodside JV.In vitro isoflavone supplementation reduces hydrogen peroxide-induced DNA damage in sperm.Teratogenesis,carcinogenesis,and mutagenesis.2002;22:227-34. 

3Bennetts LE，De Iuliis GN，Nixon B，Kime M，Zelski K，et al.Impact of estrogenic compounds on DNA integrity in human spermatozoa：evidence for cross1inking and redox cycling activities.Mutat Res 2008;64l：1-11.