[发明专利]使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法

权利要求书

1.使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，依次包括牛冷冻精液的前期处理、受精前精液的获能处理和与加入卵母细胞的受精滴进行体外受精三个阶段，其特征在于：在第一阶段牛冷冻精液的前期处理中使用的SP-TALP洗涤液洗涤时向含有牛精液的SP-TALP洗涤液中加入含有1‰DMSO的染料木黄酮，或在第二阶段受精前精液的获能处理阶段中向含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE获能液的混合液内加入含有1‰DMSO的染料木黄酮，或在第三阶段体外受精过程中制备含有卵母细胞的受精滴时加入含有1‰DMSO的染料木黄酮；其中每支牛冷冻精液的受精过程中，前两个阶段中加入含有1‰DMSO的染料木黄酮时，染料木黄酮在加入液体中的终浓度为10μmol/L；在第三个阶段加入含有1‰DMSO的染料木黄酮时，染料木黄酮在含有卵母细胞的受精滴与牛精液混合液中的终浓度为10μmol/L。

2.根据权利要求1所述使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在第一阶段牛冷冻精液的前期处理中加入染料木黄酮的具体过程是：取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中以1500-2000r/min的速度离心5-8min，弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液中混合均匀，并向牛精液和SP-TALP洗涤液的混合液中加入含有1‰DMSO的染料木黄酮，致使染料木黄酮在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中的终浓度为10μmol/L，然后放入37℃、5%CO₂和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3个小时，然后再次收集到离心管中以1500-1700r/min的速度离心5-10min，弃上清液，保留沉淀100-120μL，再用IVF-TALP受精液调整精子浓度为3×10⁶个/mL～4×10⁶个/mL，之后放入37℃，5%CO₂和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用，受精前，将处理好的牛精液与PHE获能液按照体积比17:13的比例混合后并与含有5-6枚经体外培养成熟牛卵母细胞的受精滴等体积混合按照正常的受精过程进行体外受精。

3.根据权利要求1所述的使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在第二阶段受精前精液的获能处理中加入含有染料木黄酮的具体过程是：取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中以1500-2000r/min的速度离心5-8min，弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液中混合均匀后放入37℃，5%CO₂培养箱中温育2-3小时，再次收集到离心管中以1500-1700r/min的速度离心5-10min，弃上清液，保留沉淀100-120_μL，然后加入IVF-TALP受精液中调整精子的浓度为3×10⁶个/mL～4×10⁶个/mL放入37℃，5%CO₂培养箱中备用，受精前，将处理好的含有牛精液的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合获能液，向混合获能液内添加含有1‰DMSO的染料木黄酮，致使染料木黄酮在含有牛精液的混合获能液中的终浓度为10μmol/L，之后将其放入37℃，5%CO₂和100%饱和蒸汽的培养箱中备用，待卵母细胞培养成熟后，便可与含有5-6枚经体外培养成熟牛卵母细胞的受精滴等体积混合后按照正常的受精过程进行体外受精。