[发明专利]一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，本发明还涉及该方法制备的皮肤和毛发模型，以及该模型在对人皮肤和毛发疾病的研究，皮肤药物的筛选和开发治疗创伤和秃顶的临床产品方面的应用。属于组织细胞学和组织工程学领域。

背景技术

长期以来，皮肤学家和皮肤外科医生一直在努力实现能在临床上再生出有完整功能的皮肤，用于治疗皮肤的创伤和消除皮肤疤痕。有很多原因会造成皮肤的损害：比如遗传疾病、烧烫伤、慢性创伤如糖尿病引起的创伤。很多皮肤损害以后自身不能恢复，比如深度的大面积烧烫伤，皮肤大面积损伤后极易引发感染而导致死亡。目前，最普通的治疗方法是用手术移植自身其他部位没有损伤的皮肤到烧烫伤处。然而，这方法有很大局限性，一方面如果大面积烧伤，自身正常皮肤的来源有限；另一方面，移植后的皮肤存活率低也是目前临床面临的重大挑战。所以需要体外培养得技术来扩增细胞用于移植。目前用培养扩增的细胞结合框架蛋白如胶原蛋白一起来形成人皮肤的替代品在临床上代替完整的皮肤移植起着很大的应用价值，但该皮肤替代品只是形成薄薄的表皮和真皮，不能形成皮下组织和皮肤的附属器官像毛发、汗腺等，是没有正常功能的皮肤产品。再比如糖尿病人常见的足部溃疡，由于糖尿病人的微环境导致这种皮肤溃疡很难愈合，目前没有好的方法治疗。

组织工程学治疗脱发包含了移植皮肤组织或细胞到目标区域来诱导毛囊形成。毛囊的诱导与生长需要活性上皮细胞与间质细胞之间的持续地相互作用。然而不是所有自毛囊皮层移植所得的细胞都有能力诱导出新毛囊的生成。以往的研究表明，从人体头皮上分离出来的毛囊可以被移植到免疫缺陷的老鼠背上，之后成功地恢复到正常再生循环。通过移植体外培养突变型(TSCII基因缺乏)成纤维细胞形成的人类皮肤替代品而成功再生出毛发。然而，该再生的毛囊不能形成正常的毛干，而形成正常的毛干是判断是否形成成熟毛囊的核心要素之一。其他研究表明，由表皮细胞与间质细胞组成的皮肤替代物可用于移植来促进毛囊形成。由郑等人申请的美国专利2012/0095445，描述了在体外从分离的表皮与真皮细胞中生成毛囊的方法与试剂，这些细胞是单独培养，传代，然后组合形成其后被植入的毛囊。然而，因为毛囊必须在体外形成后再植入，这个过程是受限制的。

李等的美国专利(专利号2011/0321180)报道了从新生小鼠新鲜分离的小鼠皮肤干细胞再生成鼠类毛囊。因为新鲜分离细胞的数量是有限的，再生皮肤就需要使用培养扩增的细胞。不幸的是，多能性细胞在培养中经常会导致细胞分化造成所需细胞类型能力的丢失。另外这个发明专利没有报道人的皮肤和毛发的再生。这个研究是用的是新鲜分离的老鼠细胞，而不是体外培养的人细胞。

总之，在目前，世界上还没有能用体外培养扩增的细胞来再生出完整有功能性并带有成熟毛发的人的皮肤。

发明内容

我们发明了人类皮肤多功能细胞的分离和培养方法，以及移植该培养的细胞到小鼠身上再生出完整的有功能人类皮肤的技术。该技术包括通过获取多功能表皮和真皮细胞的分离方法、多功能表皮和真皮细胞体外增殖并维持多功能性的培养方法。通过上述技术方法再生的人类皮肤含有带有正常表皮、真皮和一个完整的皮下组织层。该再生的皮肤含所有的皮肤附属品包括毛发、皮脂腺、汗腺、神经和血管。而再生的毛发拥有正常色素并能周期循环生长的成熟的人类毛囊。再生的皮肤在小鼠上所覆盖的面积在0.1～2cm²区域内，每1cm²可产生50-2000个成熟的毛囊。

本发明的技术方案是：一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本；另外来自任何组织的SOX2基因表达的间质细胞和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞；

（2）将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶（Dispase蛋白水解酶）于低温4℃过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分；

（3）将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶（typsin）中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离出多功能真皮细胞；