[发明专利]一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法

权利要求书

1.一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括：（1）获取多功能表皮和真皮细胞；（2）多功能表皮和真皮细胞体外增殖；（3）培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后制成混合细胞悬浮液；然后将混合细胞悬浮液转移到半渗透性聚合物或硅胶膜底物上，并进行孵育，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性；（4）移植到受体的方法。

2.如权利要求1所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，所述步骤（1）为选自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的多功能表皮和真皮细胞；另外来自任何组织的SOX2基因表达的间质细胞和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞。

3.如权利要求2所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本；

（2）将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶于低温4℃过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分；

（3）将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离出真皮细胞；

（4）从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞用任何可供细胞自然生长的培养基培养；所述表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10μM Rock蛋白激酶抑制剂来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境接近人体生理环境；

（5）真皮细胞培养每5天换一次培养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90%覆盖率就进行传代；真皮细胞按1：3-6比例传代，传2-6代；表皮细胞按1：2-4的比例传代，传2-4代；

（6）培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后以表皮细胞：真皮细胞为1-10：1的数量比在DMEM/F12培养液中混合制成混合细胞悬浮液；然后将混合细胞悬浮液转移到带有3.0μm透气孔径的半渗透性聚合物或硅胶膜底物上，并于37℃环境中孵育1-2个小时，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性；

（7）移植细胞到受体：先在受体上切掉一块0.5-2.0平方厘米大小的完整皮肤组织形成无皮肤组织但没损害皮下肌肉组织的创口；然后将附着有真皮细胞和表皮混合细胞液的底物覆盖在整个伤口上，细胞面接触伤口，底物面朝上；并将底物与皮肤缝合，包扎。

4.如权利要求2所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本；

（2）将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶于低温4℃过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分；

（3）将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37℃水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离出真皮细胞；

（4）从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞用任何可供细胞自然生长的培养基培养；所述表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10μM Rock蛋白激酶抑制剂来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境接近人体生理环境；

（5）真皮细胞培养每5天换一次培养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90%覆盖率就进行传代；真皮细胞按1：3-6比例传代，可传2-6代；表皮细胞按1：2-4的比例传代，可传2-4代；

（6）培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后以表皮细胞：真皮细胞为1-10：1的数量比在DMEM/F12培养液中混合制成混合细胞悬浮液；

（7）然后将混合细胞悬浮液直接注入皮肤或毛发需要的再生部位，形成毛发。