[发明专利]一种微液滴式PCR芯片及其制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学应用仪器领域，具体地，涉及一种微液滴式PCR芯片及其制作方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，或称无细胞克隆技术(Free bacteria cloning technique)，作为分子生物学和基因工程的一项重要技术，其是一种在引物引导下选择性扩增DNA和RNA片段的方法，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。现阶段生物工程采用的PCR扩增仪可对所需要的目的基因片段进行连续多次扩增，并可以复制到几百万倍数量级的数目，广泛应用于以获得目的基因或基因片段为目的的生命科学，医学工程，遗传功臣，疾病诊断等许多领域。

微液滴技术在生物化学领域迅速发展，基于微液滴技术可以操控微小体积的液滴，并可以实现微液滴的稳定生成、表面处理、破裂、融合及多层液滴制备，因此微液滴可用于容器进行微生物培养、反应酶分析、微球颗粒的形成等。

经检索发现，一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片及其制作方法（中国专利公开号103103120A），此专利中描述了一种传统PCR芯片的结构及制作方法。

相对于传统的PCR芯片，微液滴式PCR芯片具有产出PCR反应液滴的粒径稳定、均一并且可操控性强的特点，因此能够较为方便快捷的形成反应酶、反应物与催化剂等物质的融合。

微流控芯片的通道尺寸在微米级别，因此液体流动为低雷诺数层流状态。因此可以利用这种流动效果进行生物化学实验，但是在微通道中实验又有自己本身的缺点，如微腔室的试剂的混合效果不好、样本的需求量大、分析的灵敏度低、在混合过程因为混合通道的流体流速不同造成混合不均匀等。而微液滴的提出，主要是针对试剂混合出现的各种问题，利用两种相间不相容的原理，将试剂混合后形成均一稳定的大分子粒子，并在另一相间进行PCR反应，这样使混合充分，不会造成混合通道的堵塞，充分利用反应样本试剂，提高了反应物的PCR合成的效率。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种微液滴式PCR芯片及其制备方法，根据本发明制作出一种以微液滴形式反应的PCR芯片，更为有效的形成尺寸均一、单分散性和数量实验条件有具体要求的PCR液滴，具有较快形成大量PCR液滴、实时性强、制作成本低等特点。

根据本发明的一个方面，提供一种微液滴式PCR芯片，该芯片采用双层设计，上层为PDMS图形化盖片，下层为玻璃基底，上、下两层采用真空氧等离子体键合封装为一个完整的微液滴PCR芯片；

所述PDMS图形化盖片从左到右依次包括：DNA目标片段与引物注入口、单相液滴成型微结构、PCR反应酶和mRNA底物注入口、油相试剂注入口、液滴直线通道、十字混合通道、微液滴缓冲通道、微液滴PCR反应腔室及微液滴PCR废液腔室，其中：DNA目标片段与引物注入口、PCR反应酶和mRNA底物注入口、油相试剂注入口为并行的3个试剂注入口，每个注入口均设置有单相液滴成型微结构；液滴直线通道、十字混合通道、液滴缓冲通道为从左至右相互连接的试剂混合与流通通道；微液滴PCR反应腔室与液滴缓冲通道相连，微液滴PCR废液腔室与微液滴PCR反应腔室相连。

本发明中上层PDMS图形化盖片采用负胶显影图形化，PMDS倒模得到；将油相试剂通过油相试剂注入口注入，并通过油相试剂注入口流过十字混合通道与微液滴缓冲通道，进入微液滴PCR反应腔室，这样油相试剂就会预先浸没整个混合区域，为后续得到PCR微液滴创造一个连续环境；再将DNA目标片段及DNA引物和PCR反应酶、mRNA底物分别注入到DNA目标片段与引物注入口、PCR反应酶和mRNA底物注入口，流经单相液滴成型微结构，利用单相液滴成型微结构的多层过滤特性将大分子物质滤出，大分子物质逐一分离得到均一稳定的单相液滴；液滴通过液滴直线通道形成粒径大小相同的或相近的物质，待通过液滴直线通道后和十字混合通道的油相环境混合，由于十字混合通道的尺寸逐步变小，便会因为毛细作用将PCR反应的各个大分子物质包裹一层油相物质，进而形成微环境独立的微液滴结构；微液滴通过微液滴缓冲通道稳定后，储存在微液滴PCR反应腔室中，并为后续的PCR反应提供微液滴环境和相应试剂物质。微液滴PCR废液腔室用于储存进样时多余的试剂，同时作为PCR反应完毕后的废液排出口。