[发明专利]一种新城疫病毒的检测方法

权利要求书

1.一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（一）、设计引物及探针：

选取现有DNA序列数据库（GENEBANK）中新城疫病毒（NDV）的核蛋白（NP）基因序列进行同源性对比，根据其保守区域，设计出针对各基因片段的引物及探针；

（二）、合成及修饰引物和探针：

下游引物及探针反向互补序列RC-Probe的5’端标记生物素，得到特异性检测引物，探针Probe的5’-C6标记氨基，得到特异性探针，所述引物和探针序列分别为：

引物：

ND(NP基因)：201bp(198-398)

P1：5’-CCTCGTCTCAG ACAGGGTCAA-3’，

P2：5’-CGGCACCTATAAAGCGTTTT TG-3’，

探针及其反向互补序列：

Probe：5’-TCCTCTTGGCGATT CCATCCGC-3’，

RC-Probe：5’-GCGG ATGGAA TCGCCA AGAAGA-3’；

（三）、特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联，制成特异性检测微球（即液相芯片）；液相芯片能够特异性识别各基因片段的PCR扩增产物，并通过液相芯片检测仪读出检测结果。

2.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于：设计PCR反应，其中：第一，PCR扩增产物是抽提带有以上新城疫病毒核蛋白（NP）基因的质粒，进行PCR扩增，其反应体系（50μL）如下：去核糖核酸酶水（RNase-free water）34μL，10×TaKaRa PCR缓冲液5μL，dNTP mix((10mM/each)4μL，TaKaRa酶(5U/μl)2μL，P1(20μM)1μL，质粒DNA模板2μL，P2(20μM)2μL；反应条件设定为：95℃热启动3分钟；94℃变性30秒，52℃褪火1分30秒，72℃延伸1分钟。

3.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于：所述特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联，制成特异性检测微球（即液相芯片）的具体步骤为：

（1）、用0.1M MES(pH4.5)将探针稀释至0.2mM；

（2）、取200μL荧光编码微球贮存液(5×106)，10000r/min离心5min，弃上清，加入50μL的0.1M MES(pH4.5)，之后振荡混匀再加入0.2nmol的0.2mM寡核苷酸探针，混匀；

（3）、加入10μL的10mg/mL EDC溶液，混匀后室温避光孵育30min，再次加入相同量的EDC继续孵育30min；

（4）、加入1.0mL的吐温-20(0.02%w/v)混匀洗涤，10000r/min离心10min沉淀荧光编码微球；

（5）、弃上清后加入1.0mL的SDS（0.1%w/v）混匀洗涤后再次10000r/min离心10min沉淀荧光编码微球，加入适量的0.1M MES(pH4.5)，采用血球计数法进行计数，于2℃～8℃避光保存。

4.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于：将已经偶联新城疫病毒核蛋白（NP）基因探针的相应荧光编码微球与扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒单一基因液相芯片检测标准体系。

5.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于：所述新城疫病毒基因液相芯片检测体系的建立，具体步骤如下：分别取已经偶联新城疫病毒核蛋白（NP）基因探针的荧光编码微球各100μL，充分混合后制备荧光编码微球混合液，并用1.5×TMAC杂交液使每种荧光编码微球稀释为200个/种/μL，然后分别与一种或两种混合的PCR或RT-PCR扩增产物进行杂交，建立新城疫病毒基因液相芯片检测体系。

6.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法，其特征在于：所述引物是以现有DNA序列数据库（GENEBANK）上新城疫病毒的核蛋白（NP）基因的保守片段为靶目标，通过primer Express软件和primer prere5.0软件设计，得到新城疫病毒核蛋白（NP）基因的特异性引物。