[发明专利]一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法。

背景技术

腺病毒(Adenovirus)是一种无包膜、线性化的双链DNA病毒，能够高效感染各种哺乳动物细胞且易于扩增及纯化，被作为基因载体工具广泛用于分子和细胞生物学研究。腺病毒能在体内有效地诱导强烈的体液免疫和细胞免疫反应，被认为是目前最有应用前景的疫苗载体之一，包括用于研发HPV、HIV，乙肝、丙肝、流感、疟疾、狂犬病等疾病的疫苗。传统的腺病毒载体主要是基于人血清型AdHu2和AdHu5，其中AdHu5曾一度被应用于临床基因治疗。然而据血清型调查表明人群中约40-60%的个体中含有抗人血清型腺病毒的中和抗体，导致基于人血清型腺病毒载体的免疫效果受到体内预存的中和抗体很大程度的影响(Singh，N.等，Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy16，965-971，doi:10.1038/mt.2008.12(2008)；Sprangers，M.C.等，Journal of clinical microbiology41，5046-5052(2003))。

目前腺病毒载体的构建策略一般采用同源重组的方法，包括：(1)细胞内同源重组，此方法缺点是易受到亲代腺病毒的污染，必须经过2-3次的病毒空斑纯化，并通过多次的噬斑形成方法鉴定重组病毒；另外重组效率低下，产生重组的时间至少需要两周以上。(2)位点特异性重组，缺点是同样易受亲代病毒的污染，需要经过多次病毒空斑纯化，由于引入了Cre/loxp重组系统，会增加腺病毒发生遗传改变的几率，获得不稳定的腺病毒子代。(3)细菌内同源重组(如AdEasy^TM System)，其缺点是筛选阳性克隆比较繁琐，同时由于引入同源重组方法，腺病毒基因组在大肠杆菌中易发生突变。

因此，本领域技术人员还需要开发新的构建腺病毒载体的方法，以及开发免疫效果理想的腺病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中E1的大部份编码序列；所述的连接序列中，设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。

在一个优选例中，所述的4个片段分别是：

黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第1-6025位；

黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第6026-17279位；

黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第17280-34196位；和

黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第34197-36519位。

在另一优选例中，各片段的氨基酸位点计算基于GenBank登录号AC_000011的核苷酸序列。

在另一优选例中，利用Nde I和SnaB I两个酶切位点切除腺病毒E1的大部份编码序列，大小约为3.5kb，将其替换为含有内切酶I-Ceu I和PI-Sce I的Linker片段。

在另一优选例中，所述的骨架载体是pNEB193载体。

在另一优选例中，所述的连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种腺病毒表达载体，所述表达载体包括：改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，E1的大部份编码序列由连接序列(Linker)替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。

在另一优选例中，所述的连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间，还包括外源的抗原编码基因。

在另一优选例中，所述的外源的抗原是(但不限于)肠道病毒EV71的VP1抗原。

在另一优选例中，所述的VP1抗原的编码基因的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的另一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括：

(1)提供所述的腺病毒表达载体；