[发明专利]TALE蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型TALE蛋白及其应用。

背景技术

TALEs(Transcription activator like effectors)是由多种黄单胞菌属（Xanthomonas）细菌产生的用于激活宿主基因表达或促进自身群落化的第三类分泌蛋白(Boch and Bonas,2010;Bogdanove et al.,2010;Scholze and Boch,2011)。有报道证明TALEs蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的关系，TALEs蛋白中含有高度保守，以33-35个氨基酸为单元组成的串联重复序列，而每个单元中第12、13位氨基酸具有可变性，称为RVD(repeat-variable diresidue)，负责识别和特异结合单个核苷酸（例如，NI识别A,HD识别C,NG识别T,NN识别G或A）。通过RVD与核苷酸的相互作用，TALEs可以特异性结合靶点DNA(Boch et al.,2009;Moscou and Bogdanove,2009)。TALEs是目前将效应蛋白带到特定核酸序列的最有效方法之一(Bogdanove and Voytas,2011)。基于TALE蛋白的这一特性，已经发展出多种应用，用于定点修饰或编辑真核基因表达，包括TALE-nuclease chimeras(TALENs)技术（用于基因敲除）(Miller et al.,2011)，TALE介导的特定基因的转录激活(Miller et al.,2011)或抑制(Cong et al.,2012;Garg et al.,2012;Mahfouz et al.,2012)。

自然界中存在的TALEs蛋白的RVD中，出现频率最高的是NI(Asn-Ile)，NG(Asn-Gly)，HD(His-Asp)和NN(Asn-Asn)，分别结合A、T、C以及G或A碱基（Boch et al.,2009;Moscou and Bogdanove,2009）。在人工合成的TALEN或TALE转录因子表达基因时，也是根据要结合的靶DNA序列设计对应的TALEs RVD序列，以达到定点相互作用的效果。然而，尽管可以根据RVD的特异性来预测TALEs的靶位点，许多天然的TALEs蛋白却含有与结合位点并不匹配的RVD，标志着RVD与DNA碱基结合的特异性不是完全严格的。RVD特异性的不足限制了人工合成的TALE蛋白的应用，尤其是用于结合G碱基的NN同时也以很高的亲和性与A碱基结合，使得TALE设计中，对靶位点选择的自由度大大降低，TALE蛋白与靶位点结合的效率受到影响，潜在的脱靶效应可能性增加，尤其是在与治疗相关的对脱靶效应要求很高的应用中难以设计与靶位点结合非常严格的TALE蛋白。

2012年，Jens Boch小组和Feng Zhang小组分别鉴定了NH为特异性识别G碱基的RVD，但与G结合的效率低于NN，此外NK也特异性与G结合，但效率更低（Streubel,J.,C.Blucher,et al.(2012)；Cong,L.,R.Zhou,et al.(2012)）。

Boch小组的研究还揭示了NI、NG与碱基结合的亲和力较弱，HD、NN与碱基结合的亲和力较强，NH则介于两者之间，并将这几种RVD分别称为弱、强和中等RVD。对于较短的TALE蛋白，如含有10.5个重复单位的，若所含RVD都是弱和中等RVD，则TALE蛋白很难有效地结合到DNA序列上；对于较长的TALE蛋白，如含有17.5个重复单位的，若所含RVD都是弱RVD，也很难结合到DNA序列上。

TALE蛋白的结构分析显示，RVD中第二位氨基酸残基（每个重复单位的第13个残基）直接与DNA碱基发生相互作用，而第一位氨基酸残基（每个重复单位的第12个残基）则起到稳定RVD环的作用（Deng,D.,C.Yan,et al.(2012)；Mak,A.N.,P.Bradley,et al.(2012)）。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型TALE蛋白。

本发明的另一目的是提供所述TALE蛋白在基因工程领域中的应用。