[发明专利]一种跨膜输出蛋白基因选择克隆载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种克隆载体，包括原始载体以及插入该原始载体的启动子，其特征在于，所述的原始载体为pMBL，所述的启动子为阿拉伯糖启动子，该阿拉伯糖启动子位于pMBL载体中β-内酰胺酶基因的上游。

2.如权利要求1所述的克隆载体，其特征在于，所述的启动子来源于大肠杆菌（E.coli），其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1或2所述的克隆载体的构建方法，其特征在于，包括：

设计分别带Xba I和EcoR I酶切位点的引物，扩增阿拉伯糖启动子；将扩增产物用Xba I/EcoR I双酶切后，定向克隆到Xba I/EcoR I双酶切的pMBL载体上，获得所述的克隆载体。

4.如权利要求1或2所述的克隆载体在鉴定细菌跨膜输出蛋白基因中的应用，其特征在于，包括：

（1）酶切待鉴定基因，将待鉴定基因分别插入所述克隆载体的启动子与β-内酰胺酶基因之间的不同酶切位点，构建含不同β-内酰胺酶基因阅读框架的重组载体；

（2）将构建的重组载体转入宿主细菌，阿拉伯糖诱导后进行鉴定：

若任何一个转化子表现氨苄青霉素抗性，则待鉴定基因为跨膜输出蛋白基因，否则则为非跨膜输出蛋白基因。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述阿拉伯糖的诱导浓度为0.8～1.25%。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的宿主细菌为大肠杆菌TG₁。

7.如权利要求1或2所述的克隆载体在体外筛选细菌跨膜输出蛋白基因中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

（1）提取细菌的基因组DNA，用Sau3A I酶进行酶切后，回收酶切产物；

（2）将酶切产物连入分别用BamH I，Bcl I和Bgl II酶切的克隆载体中，转化宿主细胞，构建得到三个基因文库；

（3）对所述的基因文库进行筛选，获得跨膜输出蛋白基因。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的细菌为多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）。