[发明专利]山羊结核病PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种山羊结核病PCR检测试剂盒。 

背景技术

结核病(Tuberculosis)是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起人、畜、禽共患的一种慢性传染病。山羊结核病是由牛分枝杆菌( M.bovis)引起的一种人畜共患慢性传染病，该病被国际兽疫局(OIE)列为B类动物疾病，其传播和流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。传统的牛结核分枝杆菌检测方法主要是细菌学检查，但由于繁琐费时、检出率低、灵敏度差，已不能满足当前疫病检疫的需要。分离培养需要周期长，一般需要1~2个月。而传统的结核菌素皮内变态反应(PPD)检测方法，不断有报道存在非特异性反应。 

发明内容

本发明的目的是：提供一种山羊结核病PCR检测试剂盒，它可以快速检测山羊结核病，并且简便、灵敏、准确、特异性强。 

本发明是这样实现的：山羊结核病PCR检测试剂盒，它包括250μL 的PCR premix缓冲液，150μL超纯水，50μL的Marker DL2000，40μL浓度为10μmol/L的上引物及40μL浓度为10μmol/L的下引物， 20μL阴性对照以及20μL阳性对照；上游引物的序列为：5’- ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’；下游引物的序列为：5’- GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。 

阴性对照为超纯水。 

阳性对照标准山羊结核杆菌的PCR产物。 

PCR premix缓冲液由3 mmol/ul的MgCl₂，500pmol/ul的 dNTP 2.0μL，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μL Taq酶组成，其PH值为pH8.3。 

为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验： 

山羊结核病PCR诊断方法的建立

1、材料与方法

1、1   材料

1、1、1  病料 病料来自贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、黔南、黔东南、瓮安县等几个规模化养羊场和养羊专业户的送检材料及采集的山羊血清（或全血）。

1、1、2  菌株   牛分枝杆菌参考菌株[编号为93006(4)]购自中国药品生物制品检定所（北京）。羊大肠杆菌，羊链球菌，羊魏氏梭菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌为贵州省畜牧兽医研究所畜禽重大疫病监测防制重点实验室保存。 

1、1、3  主要试剂  Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×TaqBuffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。改良罗氏培养基，本实验室吴位珩同志惠赠。 

1、2方法 

1、2、1  引物设计与合成 

参照GenBank中牛分枝杆菌的pnca基因序列，应用DNAStar软件，遵循引物设计的基本原则，设计1对引物。5’-ATCAGCGACTACCTGGCCGAAG-3’；下游引物的序列为：5’-GTGGCGTGCCGTTCTCGTCG-3’。 

预计扩增目的片段大小为 241 bp，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。 

1、2、2山羊结核病细菌培养 

取新鲜全血接种于改良罗氏培养基上，37℃培养约15～30d，收集菌体进行抗酸染色镜检及PCR扩增。 

1、2、3   核酸的提取  取待检病料样品共约500mg，加入500μLPBS缓冲液，待检样品研磨后12000r/min离心取上清用于细菌基因组的提取。细菌基因组的提取参照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA－20℃保存。 

1、2、4  PCR扩增   PCR反应在25μL体系中进行，Primer1/2各2μL、10×Taq Buffer5μL、dNTP mixture4μL、Taq DNA polymerase0.5μL、ddH2O加至25μL，反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。取5μLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 

1、2、5  PCR反应条件的优化