[发明专利]一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法

权利要求书

1.一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯、异丙醇、含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法检测反应进程，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯；其中X=Cl或CN；

反应起始时的反应体系中，底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯的浓度为10％～30％(w/v)，含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞的用量为底物质量的10％～30％(w/w)，异丙醇的浓度为3％～12％(w/v)，其中X= Cl或CN；

含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞的制备方法为：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。

2.根据权利要求1所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖，诱导终浓度为0.2～1.0mM。

3.根据权利要求1所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

4.根据权利要求1所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的水相缓冲液浓度为20～200mM，为三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH为6.0～8.0。

5.根据权利要求4所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为pH 6.5～7.5的三乙醇胺缓冲液。

6. 根据权利要求5所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为50mM三乙醇胺缓冲液，其配置方法为：称取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去离子水700ml 溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至1000ml。

7.据权利要求6所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯的浓度为12％～20％(w/v)，其中 X=Cl或CN 。

8.据权利要求7所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应体系中加入Ca²⁺或Mg²⁺的二价金属离子，浓度为0.5-20mM。