[发明专利]大部分为二天线、二唾液酸和非岩藻糖基化聚糖结构的重组或转基因因子Ⅶ合成物

说明书

本申请是申请日为2007年7月31日、申请号为200780027968.1、发明名称为“大部分为二天线、二唾液酸和非岩藻糖基化聚糖结构的重组或转基因因子VII合成物”的发明专利申请的分案申请。 

背景技术

因子VII(FVII)是一种维他命K依赖糖蛋白，在其活化形态(FVIIa)下参与凝血过程，在存在钙和组织因子的情况下活化因子X和因子IX。FVII以具有406个氨基酸残基的单肽链形态分泌，其分子量约为50kDa。FVII包含四个特别的结构域：N端γ-羧基域(Gla)、两个“类表皮生长因子(EGF)”域、以及丝氨酸蛋白酶域。将FVII活化为FVIIa是以精氨酸₁₅₂-异亮氨酸₁₅₃域(精氨酸152-异亮氨酸153)连接的裂解为特征的。因此，FVIIa由具有分子量约为20kDa的具有152个氨基酸的轻链、和分子量约为30kDa的具有254个氨基酸的重链组成，两条链通过单二硫键相互连接(半胱氨酸₁₃₅-半胱氨酸 ₂₆₂)。 

血浆FVIIa(FVIIa,p)包含几种翻译后修饰：前十个谷氨酸被γ-羧基化，Asp₆₃(天冬氨酸)被部分羟化，Ser₅₂(丝氨酸52)和Ser₆₀(丝氨酸60)被氧-糖基化，并携带葡萄糖(木糖)_0-2和岩藻糖成分，分别地，Asn₁₄₅(天冬酰胺145)和Asn₃₂₂(天冬酰胺322)主要通过二天线的二唾液酸化(bisialylated)的复合聚糖结构而N-糖基化。 

FVII用于治疗表现为因子VIII(A型血友病)或因子IX(B型血友病)的缺失的血友病病人，以及对于表现出凝血因子的其他缺失的病人，例如，FVII的先天性缺失。FVII还用于脑血管意外的治疗。因此有必要获得注射用FVIIa浓缩物。 

获取FVIIa浓缩物的最古老的方法为从通过分馏所获得的血浆蛋白质中提纯FVIIa。 

为这一目的，EP0346241描述了富含FVIIa的馏分的制备，其在吸附后获得，接着洗提包含FVII、FVIIa以及其他蛋白质的血浆蛋白质的分馏副产物，即PPSB的预洗提液(P＝凝血素或FII，P＝转变加速因子前体或FVII，S＝斯图亚特因子或FX，以及B＝抗血友病因子B或FIX)，其他蛋白质例如为因子IX(FIX)、X(FX)和II(FII)。这种方法的缺点是获取的FVII仍然含有痕量的其他凝血因子。 

同样的，EP 0547932描述了基本上不含维他命K依赖因子和FVIII的高纯度FVIIa浓缩物的制备过程。通过这一过程获得的FVII尽管其纯度高，但仍表现出残留的形成血栓活性。 

这些方法的主要缺点是它们只能获得低产量的产品。 

而且，从献血者采集的血浆的量仍然受到限制。 

因此，自从二十世纪八十年代，编码人体因子VII的DNA被分离出来(Hagen et al.(1986);Proc.Natl.Acad.Sci.USA;Apr83(8):2412-6)，并在哺乳动物BHK细胞(幼仓鼠肾)中进行表达(EP 0200421)。申请人提交的专利申请FR 0604872也描述了FVIIa在转基因动物中的生产。 

通过这些生产方法获得的蛋白在病毒或其他致病剂污染方面更为安全。而且，这些方法获得蛋白具有基本序列，即在不同氨基酸之间的等同于基本人类序列的链。然而，人类血浆FVII包含复杂的翻译后修饰：前十个谷氨酸被γ-羧基化，Asp₆₃(天冬氨酸63)被部分羟化，Ser₅₂(丝氨酸52)和Ser₆₀(丝氨酸60)被氧-糖基化，并携带葡萄糖(木糖)_0-2和岩藻糖成分，分别地，Asn₁₄₅(天冬酰胺145)和Asn₃₂₂(天冬酰胺322)主要通过二天线的二唾液酸化(bisialylated)的复合结构而N-糖基化。特别的，N-聚糖的加入(连接到天冬酰胺的聚糖)对于外源蛋白的蛋白质的正确折叠、体内体外稳定性、生物活性以及药代动力学(例如，生物处理能力)尤其重要。因此，全部或部分翻译后修饰的变化使得蛋白一方面有失活的危险，另一方面还有致免疫的风险。