[发明专利]进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系及应用

说明书

技术领域

本发明涉及遗传育种的分子辅助育种技术，具体的说是一种快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系。

背景技术

凡纳滨对虾是我国乃至世界上养殖规模最大的虾类，其产量占世界对虾产量的60%，占我国对虾产量的80%，为了获得具有优异生产性状的养殖品种，各国科研人员纷纷开展凡纳滨对虾的选育工作，在选育过程中，了解准确的系谱信息对于减少近交、加快育种进程具有重要意义，因此，家系鉴定的工作引起科研人员的重视，王鸿霞等从10对多态性高的微卫星引物中选取6对引物对混养的家系进行鉴定，发现从20个候选雌虾中找到真正母亲的概率为88%，从30个候选雄虾中找到真正父亲的概率为78%，低于理论预测值(王鸿霞，吴长功，张留所，相建海，微卫星标记应用于凡纳滨对虾家系鉴别的研究.遗传2006，28(2)：179-183)。王霞等使用7对多态性位点对选择育种过程中的6个家系进行鉴定，在不存在其他亲本干扰的情况下可以获得大于99%的鉴定准确率，若存在亲缘关系较近的亲本干扰，使用该7对微卫星进行家系鉴定的准确率将降低(王霞，刘小林，张继泉，张成松，黄皓，相建海，微卫星用于凡纳滨对虾育种过程中亲权分析及遗传多样性的变化监测.水产学报2009，33(5)：832-839.)。

多重PCR是在同一体系中同时进行多个片段扩增的反应，使用多重PCR技术，多个微卫星位点可以在同一个反应中扩增，通过对不同长度的微卫星产物标记不同的荧光颜色，便可以同时对多个微卫星位点进行分型。这种高效、准确而成本低廉的微卫星分型体系在多种陆生生物和水产生物中均有使用(苗贵东，杜民，杨景峰，徐营，樊廷俊，陈松林:大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR技术建立及应用.中国海洋大学学报(自然科学版)2011(Z1)：97-106.聂鸿涛，李琪，孔令锋:皱纹盘鲍微卫星多重PCR体系构建及其在家系鉴定中的应用.水产学报2013(02)：207-215)，但是在凡纳滨对虾的家系鉴定中未见报道，同时由于可以对多个微卫星位点进行分析，多个位点的累计鉴定准确率提高，可以有效地提高鉴定准确率。因此本研究通过筛选高多态性的微卫星标记、构建多重PCR扩增引物组合、优化多重微卫星扩增体系、摸索多重微卫星扩增条件的方式建立用于快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星扩增体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系，实现凡纳滨对虾家系的快速准确鉴定。

为实现以上目的，本发明采用的方案为:

一种快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系，具体包括筛选高多态性微卫星位点组成多重微卫星扩增引物的组合和荧光标记，多重微卫星扩增体系和扩增温度的优化和确立。

高多态微卫星位点的筛选，具体包括：根据文章ShrimpMap:A low-density，microsatellite-based linkage map of the pacific whiteleg shrimp，Litopenaeus vannamei：Identification of sex-linked markers in linkage group4和A genetic linkage map of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei)：sex-linked microsatellite markers and high recombination rates中公布的微卫星序列结合微卫星位点所属的连锁群，选择在不同连锁群上的具有较高多态性的位点27个。使用MFEprimer在线软件评价27个位点的引物相互之间是否产生二聚体或者发卡结构，同时考虑引物的最佳退火温度，根据上述两个因素可将15对引物分成体系1和体系2两个引物体系。

所述的两个多重微卫星引物体系如下：

多重微卫星引物体系1引物组合和荧光标记如下：

LvM1F：6-FAM(羧基荧光素)-5’-GATGACCTGCCTTTCTCTGC-3’

LvM1R：5’-GGGAGAGATGATGGGAAGAAG-3’

LvM2F：ROX(羧基X罗丹明)-5’-ATGGCACAAATAGGATCTTG-3’

LvM2R：5’-GACTGGAAGAGCACTGATTC-3’

LvM3F：HEX(六氯荧光素)-5’-ATACGAAACACCCCATCCC-3’

LvM3R：5’-GTGGTCTTACCTCGTGGCTC-3’