[发明专利]一种来源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶及其应用。

背景技术

葡糖淀粉酶（Glucoamylase，EC3.2.1.3），是水解淀粉的外切作用糖酶。它能把淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，从糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。

多种细菌、真菌、酵母和植物都生产葡糖淀粉酶。特别有趣且商业上重要的葡糖淀粉酶是在细胞外产生的真菌的酶，例如来自下列的菌株：曲霉属（Aspergillus）(Svensson et al., Carlsberg Res. Commun. 48:529-544(1983); Boel et al., EMBO J.3:1097-1102(1984); Hayashida et al., Agric.Biol.Chem. 53: 923-929(1989); 美国专利号5,024,941;美国专利号4,794,175和WO88/09795)；蓝状菌属（Talaromyces）(美国专利号4,247,637; 美国专利号6,255,084; 和美国专利号6,620,924); 根霉属（Rhizopus）(Ashikari et al., Agric. Biol. Chem. 50: 957-964(1986); Ashikari et al., App. Microbio.Biotech.32: 129-133(1989)和美国专利号4,863,864)；腐质霉属（Humicola）(WO 05/052148和美国专利号4,618,579)；以及毛霉属（Mucor）(Houghton-Larsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.62:210-217(2003) 。已在酵母、真菌和/或细菌细胞中克隆和表达了许多编码这些酶的基因。

到目前为止，尚未有关于黑葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）中葡糖淀粉酶基因的研究报道。本发明对葡萄穗霉进行全基因组分析得到编码葡糖淀粉酶的基因，并将该基因在黑曲霉中表达，筛选得到高效表达葡糖淀粉酶的生物工程菌株，从而为高密度发酵和工业化生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型葡糖淀粉酶及其应用。所述葡糖淀粉酶来源于黑葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum），本发明通过基因工程手段，将葡糖淀粉酶的基因转化入黑曲霉（Aspergillus niger）中，从而构建了能高效表达葡糖淀粉酶的黑曲霉工程菌株，以弥补现有技术的不足。

本发明一个方面提供一种新型的葡糖淀粉酶，其特征在于：

1）其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的葡糖淀粉酶；

2）在1）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1）中葡糖淀粉酶活性的酶。

本发明另一方面提供了编码上述葡糖淀粉酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

本发明提供了一种用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的葡糖淀粉酶的重组表达载体， 

本发明另一方面提供了一种重组工程菌，其携带有表达上述葡糖淀粉酶基因的重组表达载体的宿主细胞。  

上述表达宿主细胞为黑曲霉。

本发明的葡糖淀粉酶及上述的重组工程菌用于制备葡萄糖。

本发明首次公开了黑葡萄穗霉的葡糖淀粉酶基因，并通过构建黑曲霉工程菌株，能在体外高效重组表达葡糖淀粉酶，摇瓶发酵酶活高达664U/mL。本发明所述葡糖淀粉酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，水解出葡萄糖，可广泛应用于淀粉糖工业。

附图说明

图1：本发明构建的pGm-Gla573重组表达载体质粒图谱。

图2：黑曲霉XUJ-1发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指95kD处为重组表达的葡糖淀粉酶。

图3：重组表达的葡糖淀粉酶相对酶活-温度曲线图。

图4：重组表达的葡糖淀粉酶相对酶活-pH曲线图。

具体实施方式