[发明专利]鹅原代肝细胞SCD1基因沉默试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及鹅脂肪代谢中一个重要基因沉默的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

硬脂酰辅酶A去饱和酶（Stearoyl-CoA desaturease,SCD）是位于内质网上的一类催化酶，是肝细胞合成单不饱和脂肪酸的限速酶，能在脂肪酸C9位置引入不饱和双键，催化饱和脂肪酸的脂酰辅酶A脱氢，其首选底物是软脂酰（16:0）和硬脂酰辅酶A（18:0），分别转化为棕榈油（16:1）和油酸（18:1），这些不饱和脂肪酸是合成甘油三酯、磷脂、胆固醇、蜡酯的重要底物。由于不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例影响着膜磷脂、脂蛋白代谢和信号转导，从而与糖尿病、动脉粥样硬化、癌症、肥胖症等多种疾病相关，具有广泛的生理生化作用，因此，SCD在近年成为研究热点，被认为是用于分析代谢疾病的主要候选基因，研究发现,SCD主要有四种亚型：SCD1，SCD2，SCD3，SCD4，普遍存在于肝脏、脑、肾、肺、脂肪等组织中。鹅的SCD目前只发现了SCD1，长约1083bp，主要在肝脏中表达。鹅鸭等经过强饲可以形成可逆的脂肪肝，农业生产中利用鹅、鸭等这种特殊生理功能生产商业肥肝。国内外学者对此领域展开了广泛研究，试图了解肥肝形成机制，为加快肥肝生产提供技术上的支持。Ntambi（1992）研究发现饮食中碳水化合物较高的小鼠肝SCD1基因表达较丰富。Cohen和Ntambi等2005年证明SCD完全缺失的小鼠饲喂高脂饲粮不易形成肥胖，而且小鼠肝脏中不易沉积脂肪造成肝脏变性。这些研究说明SCD的表达与肥胖形成和胰岛素抵抗有关。Herault等（2009）选择与脂类代谢相关部分基因检测其在填肥后北京鸭和Muscovy的肥肝中的表达发现填肥后参与脂肪酸合成的基因高表达，而且填肥后肝脏中脂肪酸合成和TG合成途径旺盛。Herault等（2009）认为SCD1可能是甘油三酯合成脂肪肝负责的关键酶。肝癌细胞SCD1水平下调和基因敲除SCD1的小鼠都会导致甘油三酯分泌速率的降低。朱丽慧（2010）利用抑制性消减杂交技术筛选鹅肥肝中差异表达基因，结果发现填肥组肝脏中SCD1的表达水平显著高于对照组，极有可能是影响肝脏脂肪代谢的主效基因。

鉴于SCD1在脂质代谢中，即在脂肪合成与脂肪酸氧化中，都发挥着举足轻重的作用。SCD1的调控对维持正常生理状态和体内脂质内环境稳定意义重大。靶向抑制SCD1的表达能使动物脂肪沉积减少，能量消耗增大，因而抑制SCD1的表达有可能成为脂质代谢异常（包括肥胖、高脂血症、脂肪肝等）的有效治疗方法。基因敲除是一种很有效的手段，但是基因敲除成本高，周期长，技术难度大，不是一般实验室所能开展。RNA干扰技术近年来被广泛应用于基因功能研究和疾病治疗领域，它不需要高难度、复杂的实验操作，不需要特殊的仪器设备，就能特异性的阻断目的基因的表达，实现目标基因的沉默效应，从而研究基因的功能。

发明内容

本发明涉及一种鹅肝细胞脂肪代谢重要基因SCD1的沉默试剂盒及检测方法。

本发明所述试剂盒包括（1）至（11）号试剂：

（1）SCD1基因的特异干扰双链siRNA（5'→3'，GCCUUCCAGAAUGACAUCUTT（SEQ ID NO.1）；

AGAUGUCAUUCUGGAAGGCTT（SEQ ID NO.2），20μmol/L）

（2）脂质体2000（转染试剂）

（3）无血清的OPti-MEM培养液

（4）反转录buffer

（5）反转录酶混合液

（6）Oligo dT引物(50μmol/L)

（7）Random引物(100μmol/L)

（8）去RNA酶双馏水

（9）荧光定量PCR特异引物（SCD1-F：5′-CACCTGGCTAGTGAACAG-3′（SEQ ID NO.3），

SCD1-R：5′-AACTCACTGGTGGAGTAGTC-3′（SEQ ID NO.4）

GAPDH-F：5′-GCCATCAATGATCCCTTCAT-3′（SEQ ID NO.5）

GAPDH-R：5′-CTGGGGTCACGCTCCTG-3′（SEQ ID NO.6），10μmol/L）

（10）高效荧光定量Taq酶混合液（2ⅹ）

（11）ROX Reference DyeⅡ(50ⅹ）。