[发明专利]高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用

说明书

本发明涉及高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用。本发明的方法包括表达人糜蛋白酶包涵体，之后对其进行变性和复性处理、纯化，复性过程中调节特定的PH值、温度、稀释比例、添加剂成分，有效地提高了可溶性蛋白的得率，所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性，阳离子交换色谱相对于阴离子交换色谱更适合于重组人糜蛋白酶的纯化，获得高纯度、高活性的重组人糜蛋白酶。重组人糜蛋白酶与糜蛋白酶应用与大鼠烫伤模型具有同样的效果。

技术领域

本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用。

背景技术

糜蛋白酶(Chymotrypsin，CT)，又称胰凝乳蛋白酶，在胰脏中以糜蛋白酶原的形态生物合成，随着胰液分泌出去。在小肠中，糜蛋白酶原受到胰蛋白酶和糜蛋白酶的作用，转变成具有活性的α-糜蛋白酶，是丝氨酸肽链内切酶。糜蛋白酶催化中心内的专一性袋穴较宽，主要作用于芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)等氨基酸形成的肽键。

糜蛋白酶的应用主要集中在医疗方面：糜蛋白酶可以分解炎症部位纤维蛋白的凝结物，促进血凝块、脓性分泌物及坏死组织的溶化分解，从而净化创面，使肉芽组织新生，促进伤口愈合。在国外，该药在眼科、皮肤科做临床局部应用己被肯定。国内临床上主要用于眼科手术，也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。近年来随着临床药理学研究的不断发展，其临床应用范围也日渐广泛。

传统的糜蛋白酶制备方法是先将动物胰脏进行酸提取，提取液进行分段盐析，除去含杂蛋白的上清液，盐析得到的沉淀即为糜蛋白酶原粗品；将粗品糜蛋白酶原再次分段盐析纯化后用胰蛋白酶激活，酶的活化液用硫酸铵低温结晶后透析、冻干后既得。该生产工艺生产时间长，收率低，并且耗费大量的试剂，增加了环境净化的成本。同时由于是从牛、猪胰脏中提取，对动物的健康要求较高，并且有潜在的病毒污染风险。

无动物源性、无血浆的生物药物是目前生物药物的国际研发前沿。从1982年第一个上市的生物药物——重组人胰岛素替代其他从动物胰腺提取的胰岛素的全面成功，到2008美国FDA批准的第一个无血浆制品--重组凝血酶的上市和销售的成功，研发无动物源性的重组人糜蛋白酶替代其他从动物胰腺提取的糜蛋白酶符合这一生物药物的发展趋势，本领域有必要开发重组人糜蛋白酶制备新工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供高活性重组人糜蛋白酶制备工艺和应用。

在本发明的第一方面，提供一种制备高活性人糜蛋白酶的方法，所述方法包括：

(1)将人糜蛋白酶的包涵体进行变性，分离含有经变性的人糜蛋白酶的上清；

(2)应用复性液进行复性，所述复性液包括100±10mM Tris-HCl；复性时，调节pH8.0±0.2、温度2～20℃(较佳地3～18℃；更佳地4-10℃)、复性液:变性液的体积比大于8(较佳地等于9)，经激活获得可溶的高活性人糜蛋白酶。

在一个优选例中，所述的复性液中，还添加按照体积0.1-0.8%甘油；较佳地添加按照体积0.4-0.6%甘油；和/或

所述的复性液中，还添加1-10mM GSH；更佳地添加2-6mM GSH；和/或

所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶。

在另一优选例中，所述的包涵体如下表达：

(a)将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；

(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人糜蛋白酶的包涵体。

在另一优选例中，还包括：破碎大肠杆菌细胞，分离获取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵体。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的人糜蛋白酶的包涵体进行洗涤。