[发明专利]高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用

权利要求书

1.一种制备高活性人糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：

(1)将人糜蛋白酶的包涵体进行变性，分离含有经变性的人糜蛋白酶的上清；

(2)应用复性液进行复性，所述复性液包括100±10mM Tris-HCl；复性时，调节pH8.0±0.2、温度2～20℃、复性液:变性液的体积比大于8，经激活获得可溶的高活性人糜蛋白酶；所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶、按照体积0.1-0.8％甘油以及1-10mM GSH。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复性液中，添加2-6mM GSH。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的复性液中，添加按照体积0.4-0.6％甘油。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包涵体如下表达：

(a)将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；

(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人糜蛋白酶的包涵体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括：破碎大肠杆菌细胞，分离获取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵体。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的变性包括：将人糜蛋白酶的包涵体溶解于变性液中变性0.5-6小时；所述变性液包含4-10M尿素以及0.1-100mMβ-巯基乙醇。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)之后，还包括DEAE-FFSepharose阴离子交换柱或CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，应用CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：对纯化产物进行冻干。

10.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，该方法依次包括：将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，发酵培养该大肠杆菌→离心收集细胞→细胞破碎→离心收集包涵体→包涵体洗涤→包涵体溶解变性→复性→微滤除菌澄清→超滤浓缩→透析→离子柱纯化→浓缩→透析→除菌过滤→冻干。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法生产的重组人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符合2010版药典对于生物制品的要求。