[发明专利]一种植物线虫临时玻片的制作方法

说明书

技术领域

 本发明涉及线虫玻片的制作方法，具体涉及一种植物线虫临时玻片的制作方法。

背景技术

植物线虫属于无脊椎动物中的线虫门，能寄生于植物根、茎、叶、果实、种子等部位，其种类繁多、危害严重。近年来，随着国际间贸易往来的日益频繁，进出境种苗及其植物繁殖材料增多，各种植物病害尤其是线虫病害传播的机会大大增加，使得植物线虫成为世界各国广泛关注的对象。我国2007年公布的对外植物检疫性有害生物名录中，有20种（属）的线虫为检疫性线虫。

对植物线虫分类鉴定和形态研究，一般首先要制作线虫玻片，线虫玻片可以分为临时玻片和永久玻片，目前线虫临时玻片制作一般直接用水做浮载剂，将线虫热杀死后加盖玻片直接观察，但线虫临时玻片只能保存数十分钟。也有人用线虫固定液（如4%甲醛溶液或FG溶液等）做浮载剂，为了防止线虫被压扁，浮载剂中放置了玻璃丝或薄纸等支撑物，盖上盖玻片后，盖玻片周围涂上透明的指甲油、树脂或凡士林等封片固定，这种线虫临时玻片可保存标本数天至数周，但其制片过程较为复杂，易产生气泡，影响观察。永久玻片如公开号为CN102640742的发明专利申请，公开了用线虫固定液将线虫热杀死并固定，然后用脱水液脱水，再用石蜡和甘油作为浮载剂，薄纸作为支撑物，指甲油作为封片剂，制成永久性玻片，可长期保存，但制作复杂，周期长，需要2-3周才制作完毕。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物线虫临时玻片的制作方法，该制作方法可有效避免气泡，制作简单，不需要支撑物，保存期较长。

本发明所要解决的技术问题是一种植物线虫临时玻片的制作方法，步骤如下：

a、用移液器从培养皿中吸取水中培养的植物线虫，转移到500μL塑料管中， 2000 r/min离心3 min，再用移液器吸出塑料管中的水（可以留下线虫液约10μL），然后向塑料管中加入95 ℃的线虫固定液200～400μL，静置至植物线虫死亡，得到已杀死固定的植物线虫，所述线虫固定液为体积百分浓度40％的甲醛：甘油：蒸馏水按体积比10:2:88配制；

b、在载玻片中央滴加上述线虫固定液2μL，挑取上述已杀死固定的植物线虫，置于载玻片上的线虫固定液内，整理植物线虫形态；整理后植物线虫沉底且均匀排列；

 c、在载玻片上线虫固定液旁的左上角和右下角各放置一块体积为2～3 mm³的石蜡，在石蜡和线虫固定液上盖上盖玻片，载玻片置于64 ℃的加热板上加热，待石蜡融化后自然冷却，得到植物线虫临时玻片。

与现有技术相比本发明的优点在于该方法通过线虫固定液热杀死并固定线虫，然后用线虫固定液为载玻片上的浮载剂，再用线虫固定液对角的石蜡热融形成均匀的蜡环，冷却后就成为致密的密闭环境，得到植物线虫临时玻片，这样石蜡既作为支撑物，又作为封片剂，就不需另外放置玻璃丝或薄纸等支撑物，也不用涂上指甲油、树脂或凡士林等封片剂，操作简单，载玻片加热时气体逸出，基本上不会产生气泡，线虫临时玻片可保存标本3个月以上，保存期也延长。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

在解剖镜下，用移液器反复从培养皿中吸取水中培养的植物线虫，转移到500μL塑料管中，2000 r/min离心3 min，使植物线虫沉降到塑料管底部，用移液器慢慢将塑料管中水吸出，为防止吸出线虫，塑料管中可留少量的线虫液（约10μL），然后向塑料管中加入95 ℃的线虫固定液200～400μL（体积40％的甲醛：甘油：蒸馏水体积比为10:2:88配制），使植物线虫杀死和固定；在干净载玻片上用移液器滴加线虫固定液2μL，用线虫挑针挑取一条或数条已杀死固定的植物线虫至载玻片上的线虫固定液内，在解剖镜下整理植物线虫形态，使植物线虫沉底且均匀排列；在载玻片上的线虫固定液旁的左上角和右下角对称放置两块体积为2～3 mm³的石蜡，在石蜡和线虫固定液上盖上盖玻片，载玻片置于64 ℃的加热板上加热，待石蜡融化后自然冷却（加热时间一般为30 s），加热时石蜡融化并在盖玻片下形成均匀的蜡环，蜡液和线虫固定液中气体随温度上升逸出，冷却后石蜡就成为致密的密闭环境，得到植物线虫临时玻片；加贴标签，制作完成，可保存数月。