[发明专利]一种雷莫拉宁发酵液的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及到雷莫拉宁发酵液的纯化方法。

背景技术

新型糖肽类抗生素雷莫拉宁由游动放线茵发酵液分离获得。雷莫拉宁是一种新型的糖肽类抗生素，主要抑制革兰氏阳性菌的生长。原料药是由A1、A2、A3三个组分组成的混合物，其中A2为主要成分，占80%以上。雷莫拉宁能够特异而迅速地抑制革兰氏阳性菌细胞壁的生物合成。这种抑制作用与万古霉素和替考拉宁的抑菌机制不同，且对多种耐药致病菌具有很好的抑菌效果。目前主要开发用于G+菌及其耐药茵引起的皮肤感染及痢疾等胃肠道炎性疾病的治疗。它与现有糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁的抑菌机制不同，雷莫拉宁主要通过结合转糖基酶的作用底物，使细菌细胞壁合成受阻并致细胞凋亡。体外试验表明，雷莫拉宁对葡萄球菌的抑菌率是万古霉素和替考拉宁的4～8倍，而对链球菌、肠球菌、棒状杆菌、梭菌等多种革兰氏阳性菌都有很强的抑菌活性。另外，雷莫拉宁对许多具有耐药性的病原菌有很好的抑菌效果.雷莫拉宁的细胞毒性较小且无交叉耐药问题。但因其分子量较大，故胃肠道难于吸收。目前，雷莫拉宁主要开发为外用药物。雷莫拉宁在治疗痤疮、感染性外伤以及腹泻感染等病症上已取得了良好的效果，并且已进入了临床三期试验。

雷莫拉宁为生物发酵制品，纯化分离难度较高，目前使用的分离纯化方法有大孔树脂吸附法和HPLC分离法，上述两种方法的操作过程繁琐，并且要求有较高的操作技巧，否则对纯度有较大影响。对于HPLC分离法，该方法的成本较高，并且不适用于工业生产。

为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种雷莫拉宁发酵液的纯化方法，使用该方法对操作者的操作技巧要求低，并且分离效果好，纯化度高。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种雷莫拉宁发酵液的纯化方法，包括以下步骤：

a）调节雷莫拉宁发酵液的pH至4~5，使发酵液沉淀，沉淀后离心分离得到滤饼和滤液，在滤饼中加入70%的乙醇溶液萃取，其乙醇溶液的质量为滤饼质量的10倍；将萃取液和滤液使用超滤膜过滤，收集过滤液，得到A液；

b）将A液浓缩，调节其PH至4~5，使用凝胶色谱进行分离，得到B液；

c）将B液浓缩，然后冷却结晶、过滤和干燥得到成品。

在本发明中，超滤膜将大分子的杂质去除，因此选择超滤膜的截留分子量为10000，通过超滤膜去除分子量大于10000的大分子物质。为使超滤膜过滤效果增强，超滤膜的过滤压力为0.1~0.2MPa。

凝胶色谱分离过程中，均会使用到分离柱体和流动相。在本发明中，流动相为质量分数为50%~100%的乙醇水溶液和2%~5%的氯化钠溶液的混合液，与50%~100%的乙醇溶液。并且，凝胶色谱的流动相流速为0.5ml~1.5ml/min。

优选的，凝胶色谱采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，分离用柱体的长度为2~3m。

综上所述，本发明具有以下优点：本发明公开的纯化方法，操作过程简单，经过超滤和凝胶色谱分离后，分离效果好，纯化度高。

附图说明

图1为实施例1中雷莫拉宁在凝胶色谱中流出时间与对应流出液中雷莫拉宁浓度的曲线图；

图2为实施例2中雷莫拉宁在凝胶色谱中流出时间与对应流出液中雷莫拉宁浓度的曲线图。

具体实施方式

实施例1

取发酵液，调节雷莫拉宁发酵液的pH至4，使发酵液沉淀，沉淀后离心分离得到滤饼和滤液，在滤饼中加入70%的乙醇溶液萃取，其乙醇溶液的质量为滤饼质量的10倍。将萃取液和滤液使用超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量为10000，其过滤压力为0.1MPa；收集过滤液，得到A液。

将A液浓缩，浓缩至原体积的十分之一，调节其PH至4，使用凝胶色谱进行分离，收集洗脱液，得到B液。凝胶色谱的分子筛使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，将其装柱，柱体的高度为2m。

凝胶色谱分离过程中，先使用质量分数为50%的乙醇溶液和2%的氯化钠溶液的混合液作为流动相进行洗脱，其混合的体积比例为80:20；然后使用50%的乙醇溶液进行洗脱，洗脱过程中流动相的流速为0.5ml/min，其洗脱过程如图1所示。在上述的两组洗脱液中，50%的乙醇溶液和2%的氯化钠溶液构成的混合液与50%的乙醇溶液的体积比为20:80，即总洗脱液中20%为50%的乙醇溶液和2%的氯化钠溶液构成的混合液。