[发明专利]黄曲霉毒素M1金标快速检测卡及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，所述检测卡包括检测条和塑料卡壳，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成；所述金标结合垫为包被有胶体金颗粒标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体的玻璃纤维、硝酸纤维素膜包被有隐性黄曲霉毒素M1蛋白偶联物的检测线（T线）以及羊抗鼠单克隆抗体的控制线（C线）。 

2.如权1中所述黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，其特征在于金标结合垫上的胶体金颗粒标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体是黄曲霉毒素M1单克隆抗体与25um的胶体金颗粒通过物理方法结合在一起的产物，抗体标记量为3ug/ml。 

3.如权1所述黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，其特征在于所述检测线上包被的黄曲霉毒素M1蛋白偶联物的浓度为0.1mg/ml，包被量为1μl/cm；控制线上包被的羊抗鼠单克隆抗体的浓度为1mg/mL，包被量为1μl/cm。 

4.一种权种要求1所述的黄曲霉毒素M1金标快速检测卡的制备方法，包括以下步骤： 

1）金标抗体结合垫的制备 

a.空白胶体金的制备： 

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，制备方法为用量筒量取浓度为0.01%的氯金酸溶液100ml，加入带有磁力搅拌子的烧瓶内，置于加热磁力搅拌器上高速加热搅拌，等液体完全沸腾后加入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液1.5ml；当溶液的颜色转变为桔红色且不再发生变化时保持沸腾状态10min，10min后取下烧瓶于室温自然冷却，最后取出转子，4℃避光冷藏保存； 

b.金标抗体重悬液的配制 

第一步用分析天平称取Tris0.605g，加入1L烧杯中； 

第二步用分析天平称取蔗糖25.000g,加入以上烧杯中； 

第三步500ml量筒量取纯水500ml，加入上述烧杯中，使其充分溶解； 

第四步于磁力搅拌器上温和搅拌，使各组份充分溶解、混匀； 

第五步将上述液体用4NHCl调节pH值至8.2±0.1； 

第六步用分析天平称取牛血清白蛋白（BSA）5.000g，加入以上烧杯中； 

第七步再次于磁力搅拌器上温和搅拌，使BSA充分溶解、混匀； 

第八步将上述液体用0.22um微孔滤膜无菌过滤，过滤后的液体装入500ml试剂瓶中，贴签，4℃备用，保存有效期2个月； 

c.胶体金标记抗体的制备： 

取空白胶体金溶液100ml于三角烧瓶中，置磁力搅拌器上低速搅拌，加入0.1M碳酸钾溶液150～200ul，保持7-10分钟后，在搅拌状态下缓慢加入浓度为0.2mg/ml的黄 曲霉毒素M1单克隆抗体进行抗体胶体金标记，使抗体终浓度达到3ug/ml，继续搅拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之终浓度达到0.4%，持续搅拌30min，最后离心，弃去未结合的游离蛋白，用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充分重悬后备用； 

d.金标抗体结合垫的制备： 

将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为1cm*30cm的玻璃纤维素膜上，包被量为2ml/30cm，37℃干燥过夜，密封避光干燥处保存； 

2）包被膜上T、C线的包被 

a.黄曲霉毒素M1-蛋白偶联物的制备 

2mgAFM₁与4mgCMO溶解于400μl吡啶中，25℃避光振摇反应24h后将反应产物冷冻干燥；称取0.2mg的反应物溶于100μlDMF-水中，加入EDC30mg，避光混匀；再加入0.5%OVA溶液，25℃避光、100r/min反应4h，再补加EDC5-10mg，继续反应20h。将偶联产物装入透析袋，在0.01mol/LPBS中置4℃透析袋3天，期间换透析液3次；

b.T、C线的包被 

调试好二维喷点平台，将权利3中配制好的蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为控制线，37℃干燥2h，密封避光干燥处保存； 

3）试纸条的组装 

按权1中的要求将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条，最后固定在塑料卡壳内。 

5.根据权利要求4所述一种权种要求1所述的黄曲霉毒素M1金标快速检测卡的制备方法，其特征在于所述黄曲霉毒素M1-蛋白偶联物的制备步骤中，所述100μlDMF-水中DMF与水的体积比为6：9。