[发明专利]一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用

说明书

  

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用。 

  

背景技术  

据估算，地球上每年有大约1500万人死于传染性疾病，大约占到总死亡人数5700万的25%。疫苗接种是人类对抗细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病的有效手段，一直是人们关注和研究的热点之一。基因工程载体疫苗，指利用非致病微生物作为载体，将病菌的保护性抗原基因片段重组到载体微生物中，用表达保护性抗原的微生物作为疫苗。痘苗病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒等是常用的病毒载体，沙门氏菌和卡介苗则是常用的细菌载体。这些疫苗载体的共同特点是，它们多为致病菌的减毒苗，可能存在潜在的危害性。如能利用非致病菌尤其是益生菌作为疫苗载体，将大大提高疫苗的安全性。

乳杆菌（Lactobacilli）是乳酸菌中最大的一个属，长期以来一直被应用于食品发酵和保存中（酸奶中含有多种乳杆菌），被公认为“安全级”（generally recognized as safe，GRAS）微生物，因此用乳杆菌作为载体传递抗原进行免疫有着诱人的前景。这些菌株经过分子遗传修饰，带有目的病原的抗原成分，口服或注射后，可以产生特异的局部或全身免疫反应。而乳杆菌自身的一些特点，如：在肠道吸附定植的能力；对胃酸、胆汁的耐受性；产生抗菌物质的特性等，更使其成为基因工程载体疫苗的最佳选择。 

干酪乳杆菌是一种在食品和医疗领域具有重要应用前景的食品级微生物。近年来，干酪乳杆菌的基因克隆和表达系统引起了人们的广泛关注，其中很重要的一个研究方向就是利用干酪乳杆菌表达系统进行基因工程疫苗的构建。国内外利用干酪乳杆菌构建了能引起机体免疫应答的多株基因工程疫苗，但大多利用抗生素标记基因如氯霉素抗性基因和红霉素抗性基因作为整个系统的筛选标记，这些标记基因的生物可转移性可能危害人类健康，从而限制了这一类干酪乳杆菌基因工程疫苗在食品和医药等工业的应用。 

要想构建完全食品级的基因工程疫苗，必需同时具备食品级的宿主和食品级的载体，而且宿主和载体必需具有可以完成互补筛选的食品级标记。目前，这方面的研究主要集中在乳酸乳球菌上，对于干酪乳杆菌的研究较少。 

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号200910192146.X，公告日2010-02-24，公开了一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N，该乳酸菌食品级表达载体以天然食品防腐剂乳链菌肽Nisin抗性基因nisI作为选择标记。 

中国专利文献号CN200410093875.7，授权公告日2007-11-21，公开了一种乳酸乳球菌的食品级载体，该载体以胸苷酸合成酶基因thyA为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。 

中国专利文献号CN200610154649.4，授权公告日2010-09-08，公开了两种乳酸乳球菌食品级载体pNI1和pNI2，这两个载体分别利用乳酸链球菌素（Nisin）免疫基因nisI和抗性基因nsr为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。 

中国专利文献号CN200710175269.3，授权公告日2010-09-08，公开了一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，该载体以胸苷酸合成酶基因thyA为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。 

  

发明内容

本发明的目的在于解决上述已有技术存在的不足，提供一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统并利用该系统实现异源蛋白的成功表达，本系统中所有DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记。 

本发明的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，特殊之处在于包括食品级宿主干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）Q-5和食品级表面展示载体pQJ5。 

所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei于2013年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC,地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所），保藏号为CGMCC 7936。 

所述食品级宿主干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936是对干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ATCC 334进行质粒消除并筛选而获得，丧失了代谢乳糖的能力。 

所述质粒消除是包括亚致死高温诱导的质粒消除或新霉素诱导的质粒消除。 

所述食品级表面展示载体pQJ5，其碱基序列如序列表所示。