[发明专利]一种乳或乳制品中牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种可测定乳或乳制品中热变性和非变性的常量或微量的牛乳血清白蛋白定量的检测试剂盒。

背景技术

牛血清白蛋白（Bovine serum albuminn，BSA)是牛血清中的一种主要的球蛋白之一，也是乳清蛋白的成分之一，又称第五组分(Fraction V)，简称为BSA，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，25℃下水中等电点为4.7，主要存在于牛血清中，约占牛血清中总蛋白的52-62%；此外，在牛奶中也含有少量的血清白蛋白，约为牛奶中总蛋白的1.4%。

据报道，牛血清白蛋白最主要的生理作用为维持人体血液中的渗透压和pH值平衡，而Karjalainen（1992）等人则发现婴幼儿从牛奶中摄入的牛血清白蛋白与胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）的引发有直接的关系，其研究表明，在母乳哺喂六个月后再喂含一定量牛血清白蛋白的乳制品可大大减少婴儿引发胰岛素依赖性糖尿病的可能性。因此，研究乳及乳制品中牛血清白蛋白的量对婴幼儿的健康成长有着重要的作用。

目前国内外用于牛乳血清白蛋白检测最主要的方法为ELISA法，该法灵敏度高、特异性强，但对操作人员要求高，重现性较差，定量结果不准确，可满足样品的初筛，而准确定量尚有缺陷。经查询，至今为止还未发现应用同位素内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS测定乳与乳制品中热变性和非变性牛乳血清白蛋白的方法。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS可定量测定不同乳及乳制品中牛乳血清白蛋白含量的试剂盒。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS定量检测牛乳血清白蛋白的方法。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，所述试剂盒包括牛乳血清白蛋白特异肽，同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标；所述牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK（SEQ ID NO.1）；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK（SEQ ID NO.2，其中同位素标记*符号未显示），其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC（SEQ ID NO.3，其中同位素标记符号*未显示出），其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

作为一个优选方案，所述试剂盒还包括氯化钙（CaCl₂），碳酸氢铵（NH₄HCO₃），二硫苏糖醇（DTT），碘代乙酰胺（IAA），胰蛋白酶和甲酸。

作为一个优选方案，所述氯化钙的使用浓度是100mmol/L，碳酸氢铵的使用溶度是50mmol/L，二硫苏糖醇的使用浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺的使用浓度是500mmol/L，胰蛋白酶的使用浓度是200μg/mL。

为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理以释放特异肽：将待测样品用温水溶解，加入同位素标记牛乳血清白蛋白内标和碳酸氢铵溶液混匀，加入二硫苏糖醇溶液，碘代乙酰胺溶液，氯化钙溶液和胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入甲酸，最后加水定容，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析，所述同位素标记牛乳铁蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；

（2）步骤（1）所得样品进行液相色谱分离；

（3）样品经步骤（2）色谱分离后进行质谱检测，所用牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK；所用同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。