[发明专利]一种乳或乳制品中牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括牛乳血清白蛋白特异肽，同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标；所述牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

2.根据权利要求1所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括氯化钙，碳酸氢铵，二硫苏糖醇，碘代乙酰胺，胰蛋白酶和甲酸。

3.根据权利要求2所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述氯化钙的使用浓度是100mmol/L，碳酸氢铵的使用溶度是50mmol/L，二硫苏糖醇的使用浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺的使用浓度是500mmol/L，胰蛋白酶的使用浓度是200μg/mL。

4.一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品前处理以释放特异肽：将待测样品用温水溶解，加入同位素标记牛乳血清白蛋白内标和碳酸氢铵溶液混匀，加入二硫苏糖醇溶液，碘代乙酰胺溶液，氯化钙溶液和胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入甲酸，最后加水定容，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析，所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；

（2）步骤（1）所得样品进行液相色谱分离；

（3）样品经步骤（2）色谱分离后进行质谱检测，所用牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK；所用同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为L(V^*)NE(L^*)TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

5.根据权利要求4所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤（1）中加入的胰蛋白酶的量与样品中蛋白质的量比例为1:50—1:100。

6.根据权利要求4所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤（1）中碳酸氢铵溶液的溶度是50mmol/L，二硫苏糖醇溶液的浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺溶液的浓度是500mmol/L，氯化钙溶液的浓度是100mmol/L，胰蛋白酶溶液的浓度是200μg/mL。

7.根据权利要求4所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤（2）液相色谱分离条件如下：色谱柱为BEH300 C18色谱柱，孔径300柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

8.根据权利要求4所述的一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，其特征在于，步骤（3）质谱检测条件如下：毛细管电压3.5kv，锥孔电压35kv，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气流量900L/min，锥孔反吹气流量30L/hr，碰撞室压力3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度150℃，提取器电压3.0V，入口透镜电压0.5V，出口电压0.5V，碰撞梯度1.0；所述牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷形式，其质荷比为582.9m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.4m/z和213.2m/z，对应的碰撞能量分别为21eV和17eV；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷形式，其质荷比为589.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.3m/z和219.1m/z，对应的碰撞能量分别为22eV和16eV。