[发明专利]一种微流芯片的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微流芯片的制备方法，尤其涉及一种用于捕获肿瘤细胞的微流芯片的制备方法。

背景技术

循环肿瘤细胞通常是指来自于原发肿瘤组织，经脱落和浸染而进入人体外周血的细胞，在循环细胞转移过程中能够在不同的组织上寄居，并且可以在许多转移后的固相肿瘤上发现，因而循环肿瘤细胞可以作为早期肿瘤诊断的重要标志。另外循环肿瘤细胞在肿瘤的转移和复发中也起到重要作用。因此，对于循环肿瘤细胞生理机制的研究具有非常重要的意义。然而循环肿瘤细胞的数目及其在人体外周血中的绝对浓度非常低，使得针对循环肿瘤细胞的研究变得非常困难，因此对循环肿瘤细胞的分选和捕获是一个重要的研究课题。

目前，常用的细胞分选技术是流式细胞术，但是该技术使用的设备昂贵、体积庞大、需要专业人员进行操作，而且细胞的用量较大，难以在实验室和医院普及推广。微流芯片技术具有微型化、集成化、自动化和细胞试剂用量少、污染风险低等优点。近期，在微流芯片中使用较多的肿瘤细胞捕获方法是利用针对某些肿瘤细胞中上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的特异性表达进行特异性分选。该方法先对基底材料进行特定的表面处理使之具有纳米结构，然后进行表面化学修饰将Anti-EpCAM抗体偶联到基底上来捕获肿瘤细胞。但是EpCAM作为一种上皮细胞表面标记物，在不同类型的肿瘤细胞中的表达程度不同，其使用受到肿瘤细胞种类的限制。另外，对于基底的化学修饰步骤繁琐耗时，增加了不确定因素干扰试验的成功率。另外还有通过操控声表面波的驻波，利用声辐射力来直接操控肿瘤细胞进行分选和捕获；采用介电泳的方法，利用电介质粒子在不均匀电场中受力的不同对细胞进行分选和捕获，但是这些方法都不可避免的对细胞活性产生不良影响。另外，应用目前微流芯片的制备方法得到的芯片，在捕获肿瘤细胞后，缺乏在芯片上分析细胞的能力，需要转移至离心管后才能进行后续试验，该转移过程不易做到并且会造成大量细胞损失。

发明内容

为此，本发明提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的一种微流芯片的制备方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种微流芯片的制备方法，该方法包括如下操作：

掩膜制备操作：设计两种掩膜，在胶片上制备相应的掩膜，所述掩膜包括感光区和非感光区，其中，

第一掩膜的感光区包括第一封闭图形及与所述第一封闭图形间隔一定距离的带状图形，第二掩膜的感光区包括在所述第一封闭图形的基础上平行扩大至与所述带状图形相连形成的第二封闭图形以及所述带状图形；

第一刻蚀操作：将第一掩膜置于玻璃铬板上进行第一次刻蚀，形成高度为15～25um的凹陷部和沟道；

第二刻蚀操作：在玻璃铬板上放置第一掩膜的位置处放置第二掩膜后进行第二次刻蚀，形成高度为25～35um的凹陷部和沟道以及高度为15～25um的隔挡部，得到基片；

键合操作：将所述基片与盖片进行键合。

根据本发明的制备方法得到的微流芯片，由于形成的凹陷部作为捕获肿瘤细胞的区域，其中隔挡部顶端和基片以及隔挡部顶端与凹陷部的底部具有一定距离，形成一个相对的微台阶结构，这样将尺寸较大的肿瘤细胞（一般在25～35um）拦截在捕获区，而尺寸较小的血细胞（一般在15～25um）通过隔挡部上部以及沟道流出，因此可以在捕获区有效地分选到大部分的肿瘤细胞。该芯片操作简便，被捕获的细胞可保持良好的活性，透明地玻璃基底便于对捕获的细胞进行实时的原位观测。对于被捕获与固定在芯片中的肿瘤细胞可进行一系列的后续试验，如免疫荧光染色、荧光原位杂交等，应用该方法制备得到的芯片在与细胞相关的研究和临床领域中具有广阔的应用潜力。其中，在制备掩膜时主要是利用CorelDraw软件设计掩膜图形，采用高分辨率的激光照排机在胶片上制得掩膜。一般在第二刻蚀操作完成后，需要再次放入去铬液中对刻蚀完的玻璃铬板进行除铬，去除裸露的铬层。在键合操作中，是将刻蚀有微结构的玻璃基片与聚二甲基硅氧烷层经过氧等离子处理后使聚二甲基硅氧烷层与玻璃基片键合在一起。

可选地，根据本发明的制备方法，其中在第一掩膜和第二掩膜中包括至少一个带状图形。

根据本发明的制备方法，在第一掩膜和第二掩膜上的带状图形，在进行刻蚀后，形成沟道，当具有一条带状图形时，形成一个沟道，这样小分子细胞可以集中流出，当选择多条带状图形时，小分子细胞流出更加顺畅。

可选地，根据本发明的制备方法，其中所述第一掩膜和所述第二掩膜进一步地包括环状封闭图形，所述环状封闭图形与所述带状图形连接。