[发明专利]一株产L-氨基酸氧化酶的重组菌株的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及酶学领域中一种生产L-氨基酸氧化酶的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-氨基酸氧化酶是一种黄素蛋白酶，能立体特异性氧化L-氨基酸脱氨，生成对应的α-酮酸、氨和过氧化氢，并伴随氧气的消耗。能被应用于L-氨基酸的定量分析、DL-氨基酸的拆分和α-酮酸的制备。近年来，有文献报道了L-氨基酸氧化酶具有抗菌、杀虫、抗病毒等生物活性，还具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用，其在生物医药领域具有广阔的应用前景。

研究发现L-氨基酸氧化酶广泛分布于蛇科动物中，后来发现在细菌Rhodococus opacus、Pseudoalteromonas luteoviolacea、Bacillus carotarum及一些海洋微生物中，不同物种来源的L-氨基酸氧化酶底物差异性较大，有些作用于几种甚至十几种氨基酸，有些只作用于一种氨基酸，等电点、稳定性等理化性质不尽相同，基因序列也有差异，生理及生物活性不一样，结构也不尽相同。

目前为止，只有很少的L-氨基酸氧化酶异源表达的报道，2003年，第一个L-氨基酸氧化酶细菌异源表达系统被报道，研究人员将浑浊红球菌L-氨基酸氧化酶基因序列克隆到大肠杆菌中，发现在大肠杆菌表达系统中获得了大量的包涵体。之后也有一些异源表达的报道，虽然L-氨基酸氧化酶的异源表达是一大挑战，不过还是有成功潜力的，利用生物信息学方法仪器突变技术，选择合适的表达载体与系统，有望极大的提高L-氨基酸氧化酶异源表达成功率。

L-氨基酸氧化酶催化L-氨基酸生成α-酮酸的开发是值得关注的，可以用L-氨基酸氧化酶的高选择性来生产有较高生物医药价值的α-酮酸，酶法转化法具有操作简单、条件温和、高选择性、高效、无毒、无污染等优点。目前关于利用L-氨基酸氧化酶催化谷氨酸生产α-酮戊二酸的方法国内外尚无报道，因此利用这种方法生产α-酮戊二酸对环境不会有太大影响，具有很高的市场应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组生产L-氨基酸氧化酶菌株的构建方法，及重组酶的性质和应用。

本发明的技术方案：

1.将来自于Rhodococus opacus DSM43250菌株的L-氨基酸氧化酶基因(NCBI序列号：AY053450.1)提取出来与表达载体pET28a(重组蛋白形成于胞内)连接，导入E.coli BL21中构建一株重组菌株。

重组菌株构建方法：1)将PCR得到的LAAO目的基因与载体pET28a用Nco I和HindIII酶切2h，然后连接10h，用转入大肠杆菌JM109中验证。2)将构建好的重组质粒转入表达菌株E.coli BL21中，得到重组菌株，转化方法包括化学转化法，电转法，冷冻法及结合转化法，并对构建好的菌株进行测序验证。

2.将构建好的重组菌株，0.4mM IPTG诱导表达4-6h，发现重组产生酶的是包涵体没有活性，蛋白大小为58KDa，蛋白经过复性，有30％的蛋白恢复了活性，蛋白电泳图谱如图1，蛋白复性过程如图2所示。

3.蛋白包涵体有易纯化、抵御胞内蛋白酶降解及减少杂质的优点，因此通过不同的诱导方法来提高诱导表达量，发现最佳培养温度37℃，OD₆₀₀为0.5-0.6时添加0.4mmol/L的IPTG诱导培养5h，此时目的蛋白表达量达到最大。

4.对复性得到的L-氨基酸氧化酶进行生物化学特性研究，该酶最适Ph8.0，pH7-pH9之间活力保持在90％以上；最适温度45℃，在20-50℃下放置12h，酶活力在80％以上；重组酶底物特异性实验发现最适底物为L-鸟氨酸其次是L-半胱氨酸和L-丙氨酸，外源添加FAD对该重组酶活性没有影响。

5.将纯化获得的有活性的L-氨基酸氧化酶进行转化实验，以10g/L谷氨酸钠为转化底物，pH8.0磷酸盐缓冲液中45℃转化6h，可以得到α-酮戊二酸5.3g/L。

附图说明

图1  诱导表达的重组谷氨酸氧化酶蛋白电泳图谱。

图2  蛋白复性流程图。

图3  重组酶最适pH测定结果。

图4  重组酶最适温度测定结果。

图5  重组酶温度稳定性测定结果。

图6  不同底物浓度对重组酶转化测定结果。

具体实施方式：

1.重组菌株的构建：