[发明专利]一种产L-谷氨酸氧化酶重组菌株的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及酶学领域中一种产L-谷氨酸氧化酶重组菌株的构建方法及其应用。

背景技术

L-谷氨酸氧化酶目前主要发现存在于链霉菌属中，Streptomyces platensis NTU3304，Streptomyces sp.X-119-6，Streptomyces sp.Z-11-6，Streptomyces endus and Streptomyces ghanaensis都已报道可以生产L-谷氨酸氧化酶，谷氨酸氧化酶可以氧化1moL L-谷氨酸需要1moL O₂和1moL和H₂O，生成1moLα-酮戊二酸、1moL NH₃和1moL H₂O₂。目前国内外研究主要集中在利用该反应来测定食品及发酵过程中谷氨酸的含量，最近的研究发现该酶可以用来测定生物流体中谷丙转氨酶与谷草转氨酶含量，从而对心脏与肝脏疾病作出早期诊断。

L-谷氨酸氧化酶首是一种胞外酶，以FAD作为辅因子，该酶具有很高的底物专一性，而目前野生菌株生产该酶酶活产量都比较低，1993年，华东化工学院生化工程研究所的徐水清和李友荣，用链霉菌p-26，经L-谷氨酸诱导培养能形成胞外L-谷氨酸氧化酶，其粗酶液活力大约为0.2U/mL。目前对谷氨酸氧化酶重组菌株的构建也有报道，主要是来自Streptomyces sp.X-119-6的基因，产生的是包涵体或者前提，都没有活性。

而利用L-谷氨酸氧化酶来生产α-酮戊二酸的酶法转化的尚未有报道，由于酶催化反应条件比较温和，通常在常温、常压、pH值近中性的条件下进行，可减少或避免强酸、强碱或有毒物质的使用，从而减轻对环境的污染；转化率高，通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率；专一性强，不需要对集团进行保护，所形成的副产物少，手性和旋光性好等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组生产L-谷氨酸氧化酶菌株的构建方法，及重组酶的性质和应用。

本发明的技术方案：

1.将来自于Streptomyces ghanaensis ATCC14672菌株的L-谷氨酸氧化酶基因(LGOX)提取出来与表达载体pET20b(重组蛋白分泌到周质空间)与pET28a(重组蛋白形成于胞内)连接，分别导入E.coli BL21中构建两株重组菌株；目的基因可以PCR扩增出来，由大肠杆菌JM109中克隆得到。构建重组菌株的方法：

1)将PCR得到的目的基因与载体pET20b和pET28a连接，转入大肠杆菌JM109中测序验证得到正确的重组质粒。

2)将构建好的重组质粒转入表达菌株E.coli BL21中，得到重组菌株，转化方法包括化学转化法，电转法，冷冻法及结合转化法，并对构建好的菌株进行测序验证。

2.对两株重组菌株进行IPTG诱导表达，发现重组产生的是包涵体没有活性，蛋白大小为73KDa，经过蛋白复性，有30％的蛋白回复了活性；其中IPTG诱导温度为25-37℃，浓度0.4mmol/L，诱导4-6h；蛋白复性流程如图1。

3.对纯化得到的谷氨酸氧化酶进行生物化学特性研究，该酶最适pH8.5，pH7.5-pH9.5之间酶活力保持在80％以上；温度35℃，在20-40℃下放置12h，酶活力在80％以上；Mn2+对该酶酶活有明显的提高作用，外源添加FAD对该重组酶活性没有影响，该重组酶具有较高底物专一性。

4.将纯化获得的有活性的谷氨酸氧化酶进行转化实验，以谷氨酸钠为转化底物，在pH8.5磷酸盐缓冲液中35℃转化12h，可以得到α-酮戊二酸8.3g/L。

附图说明

图1L-谷氨酸氧化酶蛋白复性流程图。

图2诱导表达的重组谷氨酸氧化酶蛋白电泳图谱。

图3重组酶最适pH测定结果。

图4重组酶最适温度测定结果。

图5重组酶温度稳定性测定结果。

图6不同金属离子对重组酶活力影响测定结果。

图7不同底物浓度对重组酶转化测定结果。

具体实施方式：

1、重组菌株的构建：