[发明专利]检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒。

背景技术

口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性高度接触性传染病，主要侵害偶蹄动物，如牛、猪、羊等。其特征是发热、皮肤或粘膜发生水泡溃疡，尤其是在口腔和蹄叉部位。

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）属于小RNA病毒科，约有8500个核苷酸组成。病毒基因组由一个开放性阅读框（ORF）、一个5′端非编码区（NCR）和3′端非编码区（NCR）组成，ORF编码由4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）、RNA聚合酶（3D）、蛋白酶（L、2A、3C）以及其他非结构蛋白（如3A等）组成。口蹄疫病毒包括7个血清型和60余个亚型，7个血清型为：A型、亚洲I型、O型、C型、南非Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，各型之间无交叉保护反应，同一血清不同分离株之间也存在广泛的抗原变异；由于亚型分类越来越复杂，现在由用于分析基因组遗传衍化关系的基因型代替。

口蹄疫在亚洲主要流行有A、O型、C型、亚洲I型4个血清型，截至目前，我国仅见O型、亚洲I型、A型三个血清型的口蹄疫。亚洲I型口蹄疫是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床以口唇、蹄部、乳房等部位出现水泡、溃烂为特征。其传染性强，发病率高，传播途径多而且速度快，流行及危害的严重性仅次于O型病毒，分布于亚洲部分国家，2005年至2006年亚洲I型口蹄疫在我国大范围的爆发，通常感染牛、羊，我国未有猪感染口蹄疫亚洲I型的报道。

口蹄疫病变典型易辨认，其诊断要点为：①发病急、流行快、传播广、发病率高；②大量流涎，呈引缕状；③口蹄疮定位明确(口腔粘膜、蹄部和乳头皮肤)，病变特异(水泡、糜烂)；④恶性口蹄疫时可见虎斑心；为进一步确诊可采用动物接种实验、血清学诊断及鉴别诊断等。但口蹄疫的多个血清型均可出现以上症状，给鉴别诊断带来困难。

近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占有很大优势，引起了众多研究者的关注。荧光PCR技术是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高、特异性强、操作安全方便等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。

发明内容

本发明的目的是是采用实时荧光PCR技术，提供检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针及其试剂盒，灵敏度高、特异性强，操作安全方便，具有良好的应用前景。

本发明的技术方案为：

检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-TGCCCACTTCCTTCAAC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-TTGGACTCCTAAAGC A-3′，所述探针为5′-F-ACACCACACAAGACCGCCGTAAAC A-Q-3′，其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。

以上所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的荧光RT-PCR引物和探针，所述的F可为FAM、HEX或TET等报告荧光基团，所述的Q可为TAMARA、BHQ或MGB等淬灭荧光基团。

以上所述的F优选为FAM，所述的Q优选为TAMARA。

一种检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒,所述试剂盒包括以上所述的引物和探针。

以上所述检测口蹄疫亚洲I型病毒的试剂盒,所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。

所述的RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；

所述的RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和FMDV-Id；

所述的PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；

所述的阴性对照包括：DEPC水；

所述的阳性对照包括：口蹄疫亚洲I型全病毒。

本发明的具体原理是利用口蹄疫亚洲I型病毒的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，加入一条探针引物，通过荧光RT-PCR扩增后收集荧光信号，阳性样品产生特定的曲线。试验方法及过程如下：