[发明专利]一种制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的方法,属于生物技术(发酵工程)领域。 

背景技术

β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase，EC：3.2.1.31，简称GUS）是一种糖苷类水解酶，同时也是典型的糖基化酶，能催化各种类型的β-葡萄糖醛酸苷水解，早在50年代国外就有学者对来源于大肠杆菌和动物体的酶做了研究，之后各国学者在葡萄球菌、乳酸菌、青霉菌、曲霉菌、酵母菌等真菌，以及黄芪、拟南芥、烟草、水稻、玉米等高等植物中检测出该酶的活性。 

大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸苷酶的单体分子量为68.2kDa，常以同聚四价体形式存在。它十分稳定，在环境条件变化较大的情况下仍然具有活性，如在巯醇类还原剂β-巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)存在时表现出极高的活性。β-葡萄糖醛酸苷酶不需要辅酶因子和阳离子。一些二价重金属离子如Cu²⁺、Zn²⁺抑制其活性，但在少量的螯合剂EDTA(乙二胺四乙酸)存在的条件下维持其活性。大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸苷酶的适宜pH值为5.2～8.0，pH值4.3和pH值8.5时其活性丧失50％。其抗热半衰期为50℃下2小时。 

哺乳动物中的β-葡萄糖醛酸苷酶是一种内源酶，主要存在于内脏器官细胞的溶酶体中，是定位于溶酶体的酸性水解酶，是一个糖蛋白。该酶由四个相同亚基对称排布组成，单亚基由TIM桶状结构域、糖基结合域以及免疫球蛋白恒定域组成。该酶的催化位点位于TIM桶状结构域上的451位和540位的二个谷氨酸残基，单亚基有651个氨基酸残基，蛋白分子量为280kDa。其基因简称为gusB，长为1982bp，每个亚基含糖醛酸残基，其糖链部分是由1个N-乙酰基-D-葡萄糖胺和7个a-D-甘露糖组成。不同组织部位的β-葡萄糖醛酸苷酶理化及生物特性相似，pH值为3.6-5.8时具有最大催化活性。 

β-葡萄糖醛酸苷酶在很多领域具有应用，在医学领域，β-葡萄糖醛酸苷酶作为一种参与肿瘤侵袭和转移过程的基质降解酶。β-葡萄糖醛酸苷酶是一种酸性溶酶体酶，可水解基底膜中的主要成分——蛋白多糖，因而参与肿瘤的侵袭 和转移。由于大肠杆菌产生β-葡萄糖醛酸苷酶，而该酶可水解底物生成有色或荧光物质，利用这一特性可快速检测食品和引用水中大肠杆菌。同时，该酶还应用于人体内药物分析，特别是兴奋剂的检测。β-葡萄糖醛酸苷酶作为体内一种特异性的水解酶，检测其在体内特定部位的水平高低可应用于肿瘤的诊断。由于β-葡萄糖醛酸苷酶存在于人体细胞溶酶体和微粒体中，可大大降低一般人源性水解酶易于引发的前体药在体内非靶位被激活的可能，减少了毒副作用，因此β-葡萄糖醛酸苷酶较多的应用在前体药酶导向治疗的研究中。 

近年来，部分国内及日韩学者对β-葡萄糖醛酸苷酶催化水解甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)进行了研究。GAMG甜度是甘草酸的5倍，是蔗糖的近1000倍，是一种高甜度、低热量的新型甜味剂。GAMG极性介于GL和甘草次酸（GA）之间为中等极性，在体内同时具有良好的溶解度和跨膜转运的能力，比GL和GA具有更好的生物利用度。动物实验表明GAMG的LD50为5000mg/kg，远远大于甘草酸的LD50805mg/kg，说明GAMG比GL更安全。由于GAMG优点突出，目前已被列为精细化工产品中，因此生产和开发GAMG具有很重要的应用价值和现实意义。