[发明专利]利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及于非人哺乳动物制备重组蛋白药物领域，特别涉及一种利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法。

背景技术

血友病是人类最常见的一种出血性疾病，具有终身性，反复性和致命性，约每5000-10000个男性中就有一个是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，如辅酶凝血因子八(甲型血友病)，以及第九因子(乙型血友病)。由于血友病是由编码循环血浆蛋白的单个X连锁基因缺失引起，因此治疗血友病的重点是合成或提炼具有正常功能的凝血因子代替这种错误蛋白或缺失蛋白。

血友病的治疗最初采用全血浆，之后采用从血浆中提取的高度纯化第八因子(hFVIII)浓制剂。患者使用后者治疗，较低剂量可达到较好的疗效。这种疗法虽然可以有效控制出血，但可能会产生其它并发症。血液制品的原料一般来源于捐献者，由于检验技术有限这些血液制品可能携带传染病毒，如B型肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)，增加了患者感染病毒的风险。

重组人凝血因子(rhFVIII)对凝血因子八缺失或低量分泌所致的遗传性凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。仅2005年此药物的全球销售达到十四亿美元。它还可用于治疗创伤性出血、手术性出血、颅内出血以及其他获得性血液疾病，具有强大的市场潜力。有鉴于此，有必要提供一种高效制备重组人凝血因子的方法。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，包括以下步骤：(1)将外接信号基因的B-domain(结构域)缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件；(2)将乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中，然后将家兔受精卵在FBS B₂培养液和35℃～40℃、3％～7％CO₂培养箱中培养10-20h，之后将分裂成2～8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因家兔；(3)将乳腺表达构件通过转染至家兔供体细胞中，然后将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因家兔；(4)步骤(2)和步骤(3)获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。由此，实现第八凝血因子的乳腺表达构件在转基因家兔乳腺生物反应器表达以制备rhFVIII，转基因家兔进行快速的种群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，然后对乳汁进行分离纯化及检测，实现了rhFVIII的批量生产，都在很大程度上降低了生产成本，并且避免了使用血浆中提取的hFVIII感染病毒的风险，提高了用药的安全性。

在一些实施方式中，步骤(1)中，质粒载体为pBC₁质粒载体。由此，pBC₁质粒载体更佳适用于构建乳腺表达构件。

在一些实施方式中，步骤(1)中，乳腺表达构件包括调控元件，调控元件为鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段。由此，调控元件实使乳腺表达构件实现在家兔乳腺的基因表达。

在一些实施方式中，步骤(1)中，乳腺表达构件包括调控元件，调控元件为鸡β球蛋1白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2、β-酪蛋白外显子7，8，9、β-酪蛋白内含子7，8、β-酪蛋白基因组片段、CMV增强子。由此，调控元件实使乳腺表达构件实现在家兔乳腺的基因表达。

在一些实施方式中，步骤(1)中，信号基因为bGHployA。由此，bGHployA表达的信号肽起到较好的信号作用。

在一些实施方式中，步骤(2)中，乳腺表达构件在显微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分；