[发明专利]小鼠抗人PRRT2单克隆抗体及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及PRRT2抗体的制备和应用。具体的说，本发明提供了一种小鼠抗人PRRT2蛋白的单克隆抗体、及其制备方法和应用。 

背景技术

发作性运动诱发性运动障碍是（paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD） 是一种反复发作、运动诱发、持续时间短暂的运动障碍，呈常染色体显性遗传，表现为舞蹈症、手足徐动、投掷症、肌张力障碍等不自主运动。2011年，本申请的发明人在国际上首次发现PRRT2是家族性PKD的致病基因。 

人PRRT2位于16p11.2，有4个外显子，编码含340个氨基酸的富含脯氨酸跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2, PRRT2)。PRRT2蛋白属于CD225家族，其靠近C端有2个跨膜结构域。 

目前，几种商品化的PRRT2抗体均为多克隆抗体，特异性差，应用Western blot和免疫荧光的方法，该抗体检测结果显示明显的非特异性，从而对人PRRT2表达谱研究和功能研究受到限制。因此，制备特异性较好的小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，并应用于表达谱分析及在PKD发病中的作用具有实际作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好的抗PRRT2蛋白的单克隆抗体。 

本发明的另一个目的是提供上述抗PRRT2蛋白的单克隆抗体的制备方法。 

本发明从PRRT2蛋白序列中设计串联的多肽抗原表位，进行抗原合成，进而制备筛选出PRRT2单克隆抗体，并进行应用。 

本发明抗原表位设计采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序。通过计算如下参数来确定表面肽：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合。选择长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽作为抗原表位。为了避免不同肽片段之间产生新的抗原表位，在不同肽片段之间插入一个弱免疫原性接头GGGGS将所述肽片段串联到一起。通过全基因组化学合成的方法合成抗原表位对应的目的cDNA序列，重组到表达载体，诱导表达免疫原，纯化后多点免疫小鼠。经过了3年多时间、数以千次的试验，最终得到本发明的抗体。 

  

本发明提供了一种抗人PRRT2单克隆抗体，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条所示。较好的，其对应的抗原表位的序列如SEQ ID NO 6 或者 SEQ ID NO 7所示。

本发明提供了一种小鼠抗人PRRT2单克隆抗体，其制备方法是从PRRT2蛋白序列中选择数个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；任选组合佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。 

在本发明的一个优选例中，对所获得的抗人PRRT2单克隆抗体进行了保藏。相关产生抗人PRRT2单克隆抗体的杂交瘤细胞，是分泌PRRT2抗体的小鼠骨髓瘤融合细胞株9293-1hz-3P2，保藏号为CGMCC No.7810。CGMCC即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年7月9日。 

本发明的抗人PRRT2单克隆抗体，能够特异性识别PRRT2蛋白。 

本发明还提供了上述抗人PRRT2单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤： 

（1）   从PRRT2蛋白序列中选择1-6个肽片段作为抗原表位，通过接头将不同肽片段串联到一起；所述的抗原表位的序列选自SEQ ID NO 3- SEQ ID NO 8中的任意一条或者若干条；

（2）   合成抗原表位对应的目的cDNA序列，诱导表达串联多肽免疫原；

（3）   佐剂联合所述免疫原多点免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得单克隆抗体。

其中所述选择数个肽片段作为抗原表位，通常选2-10个，本发明选择6个 肽片段。 

其中，所述的肽片段是长度为10个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区并且位于无序区域的肽。 

在本发明的一个实施例中，所述的串联多肽免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。 

所述肽片段可以采用Abmart公司的Antigen Auto Designer抗原设计程序获得，然后通过实验检测验证。