[发明专利]一种大豆组织培养和遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养和遗传转化方法，具体涉及一种通过大豆幼胚边缘部位作为外植体，诱导产生体细胞胚，并进行农杆菌的遗传转化，进而产生转基因植株的方法。

背景技术

如今，大豆转基因技术已成为改良大豆种质资源的一种重要措施之一。目前，最为成熟的大豆转基因体系是大豆子叶节的遗传转化，然而这种方法存在嵌合体多，工作量大，随机性强，筛选难度大等缺点。Finer实验室采用大豆幼胚作为外植体，获得体细胞胚，进而获得完整植株的事实，使得该体系成为遗传转化的最佳理想体系，不过该体系依然存在再生周期长，外植体材料受限的缺点。

在外源基因的介导转化过程中，农杆菌转化和基因枪这两种方法被广泛使用，前者相对于后者的主要优点在于，成本低，容易操作，侵染范围广，拷贝数低，所以一直以来被广大专家学者所认可，但是农杆菌转化也存在后期抑菌困难，植物细胞不易修复的缺点。因此，如何缩短幼胚到植株的生长周期，使得有限的外植体获得最大的利用价值，以及如何抑制农杆菌，增加植物细胞自我修复的能力，成为大豆遗传转化能否成功的关键。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种新的大豆遗传转化体系。本发明将大豆幼胚边缘部位作为外植体，使其与培养基有更大的接触面积，缩短了体细胞胚的形成时间，增大了单位面积的体细胞数量，同时申请人意外的发现，在抑制农杆菌的过程中，加入了甲壳素多糖，不但有效地抑制了农杆菌的生长，而且增加了植物细胞的自我修复能力。本发明操作简便，效果显著，能够更优质地，更高效地得到转基因大豆。

本发明提供一种大豆组织培养和遗传转化方法，技术方案为将大豆幼胚边缘部位作为外植体，诱导产生体细胞胚，用携带有目的基因的农杆菌侵染转化体细胞胚，在侵染转化后的培养过程中添加甲壳素进行培养，进而得到转基因植株。优选地，培养基中，甲壳素用量为0.01%～0.05%；更优选地，甲壳素用量为0.02%～0.04%,；最优选地，甲壳素用量为0.03%。

本发明所提供的的方法包括大豆组织培养和遗传转化方法，其步骤如下：

1）获得大豆幼胚边缘部位外植体，并对外植体进行诱导培养得体细胞胚；

2）扩繁诱导出来的体细胞胚，用携带有目的基因的根癌农杆菌侵染体细胞胚；

3）对侵染过的体细胞胚做除菌处理，继而进行筛选继代；

4）将继代后的体细胞胚进行诱导分化，培养成再生植株。

优选地，在第1）步中，所述的大豆幼胚为大豆开花结荚两周后形成的幼胚；优选地，获得所述大豆幼胚边缘部位的方法是将大豆开花结荚两周后的豆荚，在清水中漂洗干净，再用NaClO漂洗消毒，然后无菌水洗去NaClO残留，将豆荚拨开，获得幼胚。将得到的幼胚边缘部分切下作为诱导体细胞胚的外植体，使其平的一面贴在诱导培养基上培养。优选地，培养条件为，光照16h/天，25±3℃，培养2-4个周。优选地，诱导培养基成分为：MS基本培养基（T Murashige,F Skoog(1962）A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.Physiologia plantarum,15:473～497)，4ml/L B5维生素，3%蔗糖，40mg/L2,4-D,pH值为7.0，0.2%植物凝胶。

所述步骤1）具体操作方法如下：

将大豆开花结荚两周后的豆荚，在清水中漂洗干净，再用20%的NaClO漂洗，并放于150r/min的摇床上摇动20分钟左右，然后无菌水洗去NaClO残留，冲洗5-8次，用镊子和刀片将豆荚拨开，获得幼胚。将得到的幼胚边缘部分切下，使其平的一面贴在诱导培养基上，光照16h/天，培养2-4个周，25±3℃。诱导培养基成分为：MS基本培养基，4ml/L B5维生素，3%蔗糖，40mg/L2,4-D,pH值为7.0，0.2%植物凝胶。