[发明专利]一种大豆组织培养和遗传转化方法

权利要求书

1.一种大豆组织培养和遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括将大豆幼胚边缘部位作为外植体，诱导产生体细胞胚，用携带有目的基因的根癌农杆菌侵染转化体细胞胚，在侵染转化后的培养过程中添加甲壳素进行培养，进而得到转基因植株。

2.如权利要求1所述的大豆组织培养和遗传转化方法，包括如下步骤：

1）获得大豆幼胚边缘部位外植体，并对外植体进行诱导培养得体细胞胚；

2）扩繁诱导出来的体细胞胚，用根癌农杆菌侵染体细胞胚；

3）对侵染过的体细胞胚做除菌处理，继而进行筛选继代；

4）将继代后的体细胞胚进行诱导分化，培养成再生植株。

3.如权利要求2所述的大豆组织培养和遗传转化方法，其中，步骤1）中，所述大豆幼胚为大豆开花结荚两周后形成的幼胚。

4.如权利要求2所述的大豆组织培养和遗传转化方法，其中，步骤1）的具体方法为，将大豆开花结荚两周后的豆荚，在清水中漂洗干净，再用NaClO漂洗消毒，然后无菌水洗去NaClO残留，将豆荚拨开，获得幼胚，将得到的幼胚边缘部分切下得用于诱导体细胞胚的外植体，置于诱导培养基上进行诱导培养。

5.如权利要求4所述的大豆组织培养和遗传转化方法，其中，步骤1）中所述诱导培养条件为：光照16h/天，25±3℃，培养2-4个周；所述诱导培养基成分为：MS基本培养基，4ml/L维生素B5，3%蔗糖（w/v），40mg/L2,4-D,pH值为7.0，0.2%植物凝胶（w/v），用水配制。

6.如权利要求2所述的大豆组织培养和遗传转化方法，其中，步骤2）中所述扩繁诱导出来的体细胞胚的方法为，将体细胞胚放入液体培养基中进行扩繁，

所述液体培养条件为：摇床转速150r/min，光周期16h/天,温度25±3℃；

所述的液体培养基成分为：MS基本培养基，10mM NH₄NO₃，30mM KNO₃,4ml/L维生素B5，3%蔗糖（w/v），5mM天门冬酰胺，5mg/L2,4-D，pH值为5.7，用水配制。

7.如权利要求2所述的大豆组织培养和遗传转化方法，其中，步骤3）中所述除菌处理是指，用含有500mg/L头孢霉素的除菌培养基清洗侵染过的体细胞胚，然后将体细胞胚放入含有100mg/L头孢霉素的除菌培养基中培养，一周后移入筛选培养基中进行筛选和继代；

所述除菌培养基成分为：MS基本培养基，10mM NH₄NO₃，30mM KNO₃,4ml/L维生素B5，3%蔗糖（w/v），5mM天门冬酰胺，5mg/L2,4-D，0.03%水溶性甲壳素（w/v），头孢霉素，pH值为5.7，用水配制；

所述筛选培养基成分为：MS基本培养基，10mM NH₄NO₃，30mM KNO₃，4ml/L B5维生素，3%蔗糖（w/v），5mM天门冬酰胺，5mg/L2,4-D，0.03%水溶性甲壳素（w/v），头孢霉素，筛选剂，pH值为5.7，用水配制。

8.如权利要求2所述的大豆组织培养和遗传转化方法，其中步骤4）中所述诱导分化是指将继代存活下来的体细胞团转移到M6AC培养基中，进行诱导分化得胚状体，将胚状体转移到生根培养基中进行培养，得再生植株。

9.如权利要求8所述的大豆组织培养和遗传转化方法，其中步骤4）中，

所述M6AC培养基成分为：MS基本培养基，4ml/L维生素B5，6%的麦芽糖（w/v），0.03%水溶性甲壳素（w/v），0.2%植物凝胶（w/v），0.5%活性炭（w/v），用水配制；

所述生根培养基的成分为：MSB培养基，3%蔗糖（w/v），0.2%植物凝胶（w/v），pH5.7-5.8，用水配制。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述大豆选自：合丰47、绥农28或垦丰16。