[发明专利]金黄色葡萄球菌突变株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说，本发明涉及DNA重组技术构建含登革病毒保护性抗原基因的重组金黄色葡萄球菌，以及利用该重组菌制备登革热膜泡的方法和应用。

背景技术

登革病毒（Dengue virus,DV）为黄病毒科的单股正链RNA病毒，以蚊虫为媒介进行传播。DV有4种血清型，分别称为DV-1,DV-2,DV-3,DV-4。人感染其中的任何一种血清型后均可产生对此种血清型病毒的保护性免疫，但不同型之间的交叉保护性免疫较为短暂，并且病毒感染产生的非中和抗体还可介导抗体依赖的感染增强现象(Antibody-dependent enhancement,ADE)，导致严重的登革出血热和登革休克综合症(Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome,DHF/DSS)的发生（Morens DM,et al.Microb Pathog.1987;3(4):231-7）。DV所致的登革热（Dengue fever,DF）、DHF和DSS广泛流行于热带和亚热带地区，全球有25～30亿人生活在流行区内，每年约有1亿人遭受感染，其中约100万人发展成严重的DHF/DSS，死亡率5～20％（Chaturvedi UC.J Biosci.2008;33(4):429-41）。我国也是登革热的高发区，海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区为重点流行区域，多次发生DF、DHF/DSS的爆发流行，给流行区人们的健康带来严重影响。

目前，对DV感染性疾病仍无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世。然而，登革热疫苗的研究一直备受关注，现有技术中的登革热疫苗包括以下几种：

基因工程亚单位疫苗：印度（Etemad B,et al.Am J Trop Med Hyg.2008Sep;79(3):353-63）和中国学者（Chen S,et al.DNA Cell Biol.2007;26(6):361-7）将4种血清型登革病毒E蛋白的特定区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为1:47-1:588，对各型DV的保护力差异较大，相比较而言，亚单位疫苗的保护效果不如颗粒性疫苗。

假病毒疫苗：假病毒（pseudovirus）为不含核酸的病毒空壳结构,但保留了天然病毒颗粒的空间构象，不仅可用于模拟天然病毒对宿主的感染，探索病毒侵入敏感细胞的机制，同时VLPs由病毒主要结构蛋白组成，含病毒特异的抗原表位,能够刺激机体免疫系统产生很强的免疫应答，是很有发展前景的、安全的候选疫苗。Merck公司研制的HPV6、11、16、18四价VLP Gardasil疫苗（预防宫颈癌）已于2006年6月获得美国FDA许可，成为第一个投放市场应用的VLPs疫苗，也标示着未来疫苗的发展方向。但假病毒疫苗的制备多采用哺乳动物细胞进行，产量低，成本高。

美国Schein CH等（BMC Bioinformatics.2012;13Suppl13:S9）公开了一种利用计算机针对671株DV包膜E蛋白III区（EDIII）蛋白序列设计的物理、化学性质一致的EDIII蛋白的制备方法，该蛋白免疫产生的抗体虽然保护范围广，但特异性较差，可能对特异流行株感染的保护效果不佳，不利于推广。

法国Sabchareon A等（Lancet.2012;380(9853):1559-67）报道的首个登革热疫苗—CYD-TDV重组减毒四价登革病毒疫苗能够对1、3和4型登革热病毒株具有免疫作用，但其整体效果并不理想，它对于在泰国最常见的2型登革热病毒株所起的防护作用弱。

新加坡Sim AC等（Vaccine.2008;26(9):1145-54）报道了一种表达登革病毒EDIII的重组乳链球菌制剂，但对同种或不同种小鼠的保护能力差异很大，其中的作用效果和免疫途径都有待深入进行评估。

综上所述，在登革热防治中急切需求安全性好，免疫效价高的优质疫苗。