[发明专利]金黄色葡萄球菌突变株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株，其保藏号为CGMCC No.7583。

2.一种制备权利要求1所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株的方法，其特征在于，包含步骤：

1）根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中agr基因的上下游DNA序列，设计线性基因敲除左、右臂PCR引物；通过PCR扩增、酶切、连接、转化操作构建agr基因pYT3打靶载体；

2）将步骤1）制备的pYT3打靶载体电转化到金黄色葡萄球菌RN4220的感受态细胞，并诱导其发生同源重组，经四环素负性筛选，DNA测序鉴定，得到金黄色葡萄球菌RN4220Δagr；

3）提取所述金黄色葡萄球菌RN4220Δagr细菌膜泡，经SDS-PAGE和质谱分析，鉴定RN4220Δagr细菌膜泡携带的主要抗原；其中至少有一种是金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位，其编码基因为pdhB；

4）根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中所述pdhB基因的上下游DNA序列，设计线性基因敲入左、右臂，在同源敲入左臂，即pdhB基因终止密码子前插入登革病毒包膜E蛋白III区简并序列，在同源敲入右臂前插入氯霉素抗性编码序列，构建“同源敲入左臂-简并EDIII-氯霉素抗性序列-同源敲入右臂”线性基因敲入片段，构建pYT3敲入载体；

5）将步骤4）构建的pYT3敲入载体电转化到金黄色葡萄球菌RN4220Δagr的感受态细胞，并诱导其发生同源重组，经四环素负性、氯霉素正性筛选，DNA测序鉴定，即得到所述金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述agr基因的序列如SEQ ID NO：1所示，线性基因敲除左、右臂的序列分别如SEQ ID NO：5和6所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）中，金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位的编码基因pdhB的序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）中，所述线性基因敲入左、右臂的序列分别如SEQ ID NO：8和9所示；登革病毒包膜E蛋白III区简并序列如SEQ ID NO：2所示；氯霉素抗性编码序列的序列如SEQ ID NO：4所示。

6.一种含登革病毒包膜E蛋白III区简并序列重组蛋白的细菌膜泡，其由权利要求1所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株发酵产生。

7.一种制备权利要求6所述的细菌膜泡的方法，其特征在于，包含步骤：

1）菌种准备：将权利要求1所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株接种于含氯霉素的TSB平板，经培养，挑取单个菌落扩大培养后作为种子菌；

2）发酵：将所述种子菌转种于相应的发酵瓶或发酵罐中，发酵后收集发酵上清；

3）过滤：过滤所述上清，收集过滤液再用100kDa超滤器过滤处理，收集滤过液；

4）离心：离心所述滤过液，收集沉淀；

5）梯度离心：用PBS缓冲液悬浮所述沉淀，离心后，收集10%-40%梯度界面的悬浮带，即为细菌膜泡。

8.权利要求6所述的细菌膜泡在制备预防或治疗登革病毒感染性疾病制剂中的应用。

9.根据权利要求8中的应用，其特征在于，所述制剂为疫苗。

10.一种登革热膜泡疫苗，其由权利要求6所述的细菌膜泡免疫小鼠制备而成。