[发明专利]磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于化学发光酶免疫分析技术领域，尤其涉及一种磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。

背景技术

磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SM₂）又称磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲嘧啶，是畜牧养殖业中应用最广的磺胺类药物之一，常用做饲料添加剂和细菌性疾病的治疗药物，长期添加或滥用可导致动物性食品中的药物残留，对人类健康造成威胁。研究发现，人体通过任何途径摄入都可以在体内蓄积，影响机体的免疫系统，破坏肌肉、肾脏、甲状腺等组织，同时可诱发甲状腺癌；而且，该药也可以通过胎盘和乳汁从母体向胎儿或新生儿转移，使其血浆和脑组织中的甲状腺素水平降低，这对人类和动物的脑发育有深远影响。另一方面，磺胺二甲嘧啶的残留容易诱导细菌的耐药性，使药物失去治疗疾病的价值。因此，联合国食品法典委员会和欧盟等规定，食品和饲料中磺胺类药物单个均不得超过100μg/kg；日本规定的最高残留限量为10μg/kg；2002年12月我国农业部公告第235号文件规定，在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝和肾中，磺胺类最高残留限量为100μg/kg，并将其列为兽药残留监控重点。

目前，检测磺胺二甲嘧啶的方法有微生物法、理化方法（如高效液相色谱法、薄层层析等）和免疫分析法（放射免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法等）。其中，微生物法简便、快速、廉价，适合基层现场筛查，但易受其它生物影响，灵敏度低、漏检率高；理化方法精密度高、准确度高，但是仪器昂贵、专业性强、检测时间长，可用于疑似样品的确证；免疫分析法操作简便、快速、特异、灵敏度高，近年来已被应用于多种药物残留的检测，但有关检测磺胺二甲嘧啶残留的化学发光酶免疫分析法尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种经济、简便、快速、特异、灵敏、准确的磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒和该试剂盒在动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留检测中的应用。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种特异性强的磺胺二甲嘧啶单克隆抗体。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：磺胺二甲嘧啶化学发光酶免疫分析检测法，包括以下步骤：

<1>处理待测样品；

<2>将半抗原磺胺二甲嘧啶与载体蛋白卵清蛋白的偶联物（SM₂-OVA）作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，分别加入系列标准样品或经前处理的待测样品，再加入磺胺二甲嘧啶单克隆抗体进行反应；

<3>经步骤<1>后，加入酶标二抗进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品和待测样品的发光值；

<4>以步骤<3>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中磺胺二甲嘧啶的含量。

步骤<1>参照农业部1025号公告－24-2008标准进行；步骤<2>按以下操作进行：用包被液按1:100000稀释包被抗原，每孔加入100μL，4℃孵育10h后，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入350μL封闭液，37℃孵育1h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37℃烘干后，用锡箔纸真空密封，4℃保存；将化学发光板从4℃中取出，平衡至室温，按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后每孔加入50μL磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，混匀，37℃孵育30min；倾去液体，用洗板机洗涤3次，拍干；步骤<3>按以下操作进行：每孔加入50μL1:2500稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min；倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入100μL化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值。

封闭液是5%的脱脂奶粉；磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的稀释倍数为1:1500；系列标准样品溶液的浓度为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L；包被液是pH9.6的碳酸盐缓冲液。