[发明专利]一种以月经产物制备间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于：

（1）月经产物采集

收集月经开始第2~3天的月经产物，将月经产物加入样本采集管内，样本采集管内的采集液为100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）及肝素，样本采集管可在0~12℃存放36小时；

（2）月经产物预处理

将采集的月经产物全部转移至样品杯中，加入0.1%~0.2% Ⅳ胶原酶，将样品杯封口后置于37℃恒温培养箱内震荡孵育，100~150转/分钟，30~60分钟；

（3）分离间充质干细胞

将孵育后的液体用100μm细胞筛网过滤，收集滤液，采用密度梯度离心收集单个核细胞的方法收集消化液内的月经产物来源间充质干细胞，具体操作为：在离心管内加入淋巴细胞分离液，将滤液叠加至淋巴细胞分离液上，在室温下离心，2000转/分钟，10分钟～20分钟，离心结束后可见淋巴细胞分离液层上清晰的白膜层，吸取离心后上清液至离心管，加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，混匀，室温下离心，1500转/分钟，5分钟～15分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀；沉淀中加入pH7.0~7.4的磷酸盐缓冲液，室温下离心，1000转/分钟，离心5分钟～10分钟，吸弃离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为原代月经产物来源间充质干细胞；

（4）扩增间充质干细胞

取原代月经产物来源间充质干细胞与培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80%以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液反复浸洗培养瓶底部贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125%~0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液， 静置1~3min，加入等体积的胎牛血清，再加入pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液制备细胞悬液；转移细胞悬液至离心管内，室温下离心，1000转/分钟，离心5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀中加入培养液重悬；分装细胞悬液至若干个细胞培养瓶，各瓶补加培养液；待细胞铺满瓶底80%以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增月经产物来源间充质干细胞；

（5）冻存间充质干细胞

取经扩增的月经产物来源间充质干细胞，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，静置1~3min，加入等体积的胎牛血清，再加入pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液制备细胞悬液；转移细胞悬液至离心管内，室温下离心洗涤1~2次，1000转/分钟，离心5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为待冻存的月经产物来源间充质干细胞；

将0~4℃冷藏后的细胞冻存保护液与待冻存的月经产物来源间充质干细胞混合，使细胞密度为1~3×10⁶/ml，将混合细胞后的冻存保护液分装至冻存管，分装完成后，将冻存管置于冻存盒中，在0~5℃冷藏20~40分钟，在零下80℃冷冻4~6小时，最后放入零下196℃保存，即得。

2.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中消化酶为终浓度0.1%~0.2%的Ⅳ胶原酶（Collagenase Ⅳ）。

3.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中分离间充质干细胞操作中离心参数分别为2000rpm，15min；1500rpm，10min；1000rpm，5min。

4.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中扩增间充质干细胞时细胞接种密度优化为2×10⁴/cm²，接种液体量为15ml。

5.根据权利要求1所述的一种制备间充质干细胞的方法，其中冻存间充 质干细胞时细胞冻存密度为1.5×10⁶/ml，装量为1.5ml； 

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