[发明专利]一种固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及固定化头孢菌素C酰化酶的制备方法，特别地，在固定化过程中加入醋酸盐和/或碳酸氢盐。

背景技术

CPC酰化酶是一步酶法生产7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的一种酰化酶，可以直接催化底物头孢菌素C（CPC），脱去D-α-氨基己二酸侧链，一步生产7-ACA。与传统的两步酶法相比，一步酶法操作更为简单、方便，成本低，日益受到重视。CPC酰化酶与两步酶法工艺中的GL-7-ACA酰化酶类似，均属于头孢菌素酰化酶，只是二者的催化底物特异性不同（Li Y等.Eur J Biochem,1999,262(3):713-719）。产头孢菌素C酰化酶的菌株通常都是从土壤或污水中筛选得到的，其天然菌株主要为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。Matsuda等人筛选到一株Pseudomonas sp.SE83，该菌株有两种不同的头孢菌素酰化酶活性，一种只能催化GL-7-ACA生成7-ACA，另一种却能直接催化CPC为生成7-ACA，但其活性都不高。安明等人通过对来源自Pseudomonas sp.SE83的CPC酰化酶基因进行了全局优化设计，人工合成了CPC酰化酶基因并在重组大肠杆菌中实现了高活性表达（于慧敏等，CN200810102219.7）。

固定化酶技术是产生于20世纪六十年代，目前已广泛应用于生物催化领域的工业生产中。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性高、回收方便、易于控制、可重复使用、成本低廉等优点，在两步酶法生产7-ACA的生产中的酶制剂采用的即是固定化酶技术。

酶的固定化方法可以分为四大类：吸附法、交联法、包埋法和共价结合法。吸附法是最早出现的酶固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。该法条件温和，酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间结合力弱，在不适pH、高盐浓度、高温等条件下，酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定化酶。交联法一般作为其它固定化方法的辅助手段。包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶的构象及酶分子的化学变化，反应条件温和，因而酶活力回收率较高。包埋法固定化酶易漏失，常存在扩散限制等问题，催化反应受传质阻力的影响，不宜催化大分子底物的反应。共价结合法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法，尽管该法较其它固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重，但所得的固定化酶与载体连接牢固，有良好的稳定性及重复使用性，已成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。

近年来，随着酶固定化技术的发展，人们越来越多地利用共价法固定化酶来生产各种头孢类抗生素。在两步法生产7-ACA的工艺中即广泛采用了共价结合法固定化酶（Roberto Fernández-Lafuente,et al.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,1999,7:173–179;Fernándo López-Gallego,et al.Journal of Biotechnology,2004,111:219–227）。在固定化酶的工业应用中，为了降低固定化酶的使用成本，一般要求固定化酶具有较好的活性和稳定性，可以重复、多批次的使用。因此，在一步酶法生产7-ACA技术的开发中，通过酶分子的基因工程改造、新型固定化酶载体的制备、固定化工艺的改进等，制备得到酶活高、稳定性好的固定化CPC酰化酶是至关重要的。在酶的固定化工艺中，如果能够克服共价法固定化酶活性收率低的问题并进一步提高固定化酶的催化稳定性，将为制备的固定化酶用于7-ACA的工业生产奠定基础。

发明内容

在对共价法固定CPC酰化酶的研究过程中，发明人出人意料地发现在CPC酰化酶的固定化体系中加入醋酸盐和/或碳酸氢盐，能够显著地提高固定化CPC酰化酶的活性、酶活回收率以及热稳定性。因此做出了本发明。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种固定化CPC酰化酶的制备方法，特征在于，使头孢菌素C酰化酶在醋酸盐和/或碳酸氢盐存在下与载体进行固定化。

所述醋酸盐选自醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵和它们的任意组合；所述碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵和它们的任意组合。