[发明专利]一种同步检测5种植物病毒的方法

权利要求书

1.一种同步检测5种植物病毒的方法，其特征在于通过以下步骤实现：

（1）取待测植物叶片，提取总RNA ，以提取的总RNA为模板，反转录为cDNA；

（2）以cDNA为模板，采用下列5对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；

第1对引物：

CMV-F：5'-GATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3'

CMV-R：5'-GCTCGATGTCGACATGAAGT-3'

第2对引物：

TuMV-F：5'-GTGCATTGAGAACGGAACCTC-3'

TuMV-R：5'-GATTAACGTCCTCGGTCGTATG-3'

第3对引物：

PVX-F：5'-GGATCCATGACTGCACCAGCTAGC-3'

PVX-R：5'-GAATTCTGGTGGTGGTAGAGTGAC-3'

第4对引物：

PVY-F：5'-GCGCGGATCCGCAAATGACACAATGGCATGCAG-3' 

PVY-R：5'-GCGCGGTACCTCACATGTTCTTGACTCCAAGT-3'

第5对引物：

TMV-F：5'-CAGCTGCTATTGACCTTGAAAC-3'

TMV-R：5'-CAATATCAATGATGCCAGAC-3'

（3）用TAE电泳缓冲液配制1％琼脂糖凝胶，取8μL PCR产物在水平电泳槽中进行电泳，120V/100mA电泳35分钟，根据条带图判定病毒种类；

5种植物病毒为：烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）。

2.根据权利要求1所述的一种同步检测5种植物病毒的方法，其特征在于步骤（2）多重PCR扩增反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer(Mg²⁺ free)，0.6μL rTaqDNA酶(5U/μL)，3μL dNTP Mixture(2.5mmol/L)，2μL MgCl₂(25mmol/L)，0.5μL TMV-F引物(20μmol/L)，0.5μL TMV-R引物(20μmol/L)，0.5μL CMV-F引物(20μmol/L)，0.5μL CMV-R引物(20μmol/L)，0.5μL TuMV-F引物(20μmol/L)，0.5μL TuMV-R引物(20μmol/L)，0.5μL PVX-F引物(20μmol/L)，0.5μL PVX-R引物(20μmol/L)，0.5μL PVY-F引物(20μmol/L)，0.5μL PVY-R引物(20μmol/L)，5μL反转录产物作为cDNA模板，其余用ddH₂O补充至25μL；反应程序为：94℃预变性3min后开始以下循环反应：94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸100s，35个循环结束后，72℃延伸10min。