[发明专利]蜈蚣的活性多肽及其在制药中的应用

说明书

技术领域

本发明属于天然高分子领域，也属于生化制药领域，涉及一种从动物中药体内获得活性物质，更具体涉及一种从蜈蚣中提取、分离、纯化和鉴定活性多肽的方法，同时还涉及一种蜈蚣活性多肽在制备镇痛、心脑血管药物中的应用。 

背景技术

蜈蚣始载于《神农本草经》，为节肢动物门蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch的干燥体，具有辛温走窜、通经逐邪、调达肝经之功效，是祛风镇痛、攻毒散结之要药。传统医学中蜈蚣常用于小儿惊风，抽搐痉挛，中风，半身不遂，毒蛇咬伤等。在近代医学中，应用蜈蚣治疗肿瘤、结核病、神经性头疼、糖尿病等疗效显著。 

目前，在临床应用中，蜈蚣通常是采用干燥全虫入药，也有采用干燥全虫经水提液或醇提取后入药的，无论采取哪种方法，其所用的实际是蜈蚣所有化学成分的混合物。现代药学研究表明，蜈蚣中含有蛋白质86.25％、水不溶性物质0.24％、还原糖0.23％等多种成分，但蜈蚣中已经报导的具有活性作用的成分不多。在蜈蚣众多的化学成分中，如何筛选、分离、提取出最具有药理活性的有效成分已成为人们研究的热点和重点。曾红等人曾将蜈蚣脱脂处理后，经sephadex G-25、sephadex G-150两次柱层析，分离出8种具有抗癌活性的组分，并经药理实验表明其中的E1、E6两组抗癌活性最强。(沈阳药科大学制药工程学院.曾红.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖南中医杂志，2004.20(5).57)。许鸣镝等人则采取不同的方法提取到了对人口腔上皮细胞鳞癌和人结肠癌细胞有明显抑制作用的碱性蛋白。(许鸣镝.柳雪枚.蜈蚣碱性蛋白SSmp-d的分离纯化及其部分理化性质的鉴定.生物化学杂质.1997.13(5)：586)。由此可见，采用不同的提取方法可以从蜈蚣中提取出具有不同药理活性的有效成分。 

本发明采用活性跟踪的办法，从蜈蚣体内提取、分离、纯化并鉴定出两个活性多肽，以及该活性多肽在制备镇痛、心脑血管药物中应用。 

发明内容

本发明公开了具有镇痛、抗凝和溶栓活性作用的蜈蚣活性多肽的提取、分离、纯化和鉴定方法，以及该活性多肽在制备镇痛、心脑血管药物中的应用。 

本发明的目的是这样实现的： 

本发明方法包括有一下步骤： 

a、取蜈蚣细粉，加一定量一定浓度的乙醇回流提取两次，过滤，合并滤液； 

b、所得滤液在水浴下挥干乙醇，适量蒸馏水溶解，离心，取上清液用石油醚萃取，待分层后，取水层浓缩至一定量，得墨绿色的蜈蚣粗提液； 

c、取所述蜈蚣粗提液，加入适量海藻酸，搅拌，过滤，所得滤渣用稀盐酸少量多次洗脱海藻酸，得绿色的洗脱液； 

d、向所述洗脱液中加入氯化钠至饱和，搅拌，置冰箱4℃静置过夜至完全析出并分层，收集悬浮于液面的蛋白类物质，冷冻干燥，得多肽粗品； 

e、取多肽粗品用蒸馏水溶解成一定的浓度，上样，用蒸馏水做洗脱剂，sephadex凝胶柱分离，收集峰1和峰2，冷冻干燥，其核酸蛋白仪的波谱图见附图1，液相色谱图见附图2。 

f、取峰1和峰2的冷冻样品，进行液相色谱分离，得到纯度更高的两个多肽样品1和2，其中活性最强的蜈蚣多肽分子量介于13000～14000，其中多肽样品峰1的液相色谱图见附图3。 

进一步的，a步骤中所说乙醇的浓度优选30％～85％，更进一步优选65％；优选乙醇用量为药材的2～6倍量，更进一步优选第一次提取用量为4倍量，第二次提取用量为3倍量；提取时间优选为0.5小时～4小时，更进一步优选第一次提取时间为1.0小时，第二次提取时间为0.5小时。 

进一步的，b步骤中所说的水浴温度优选40～90℃，更进一步优选75℃；离心机转速优选4000转/分钟；离心时间，优选5～30分钟，更进一步优选15分钟。 

进一步的，c步骤中以苦味酸作为检查多肽指示剂，搅拌时间优选0.5～3小时；洗脱海藻酸所用的稀盐酸，优选浓度为0.05～0.5mol/L，更进一步有选为0.2mol/L。 

进一步的，e步骤中所说核酸蛋白检测仪的检测波长优选280nm。 

进一步的，f步骤中所说液相色谱分离纯化，优选反相液相色谱，流动相优选乙腈、水和三氟醋酸的组成，镇痛活性最强多肽分子量为13616.796。 

本发明方法可有效提取、分离和纯化蜈蚣中所含的镇痛、降低血粘、促进微循环等的活性多肽，且用该方法所得的蜈蚣活性多肽杂质少、纯度高。