[发明专利]一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地，涉及一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针及其应用。

背景技术

淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）是常见的泌尿生殖系统传播疾病病原体。淋病菌感染引起的临床表现取决于感染的程度，机体的敏感性，细菌的毒力，感染的部位及感染时间的长短，同时和身体的健康状况。其潜伏期短、传染性强，最常见的是有症状的泌尿生殖系统的感染，如尿道炎、宫颈炎、附睾炎、前列腺炎、输卵管炎等，如不及时治疗，淋球菌可侵犯眼睛、眼部、皮肤、直肠、盆腔等部位，甚至可经血液传播到全身其他部位，形成淋病性关节炎、腱鞘炎、脑膜炎、败血症等。同时还有5%-20%的男性和60%的女性病人呈现出无症状感染。因此，淋球菌的实验室检测对淋病的临床辅助诊断具有重要作用。

常规检测方法包括涂片检查和培养法。双球菌涂片主要针对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者检测时阳性率在90%左右，但对于女性患者阳性率仅为50-60%且有假阳性。主要原因是女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。淋球菌培养是诊断的重要佐证，培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法，特异性为100%，只要培养阳性就可确诊。在基因诊断问世以前，培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。培养阳性率男性80-95%，女性80-90%。培养法的阳性率大于涂片法，后者对女性淋病尤其是无症状带菌者检出率较低，容易漏检。由于约50%的女性淋病患者都没有明显症状，因此女性淋病的实验室检查主要依靠培养法。与男性淋病患者有过性接触的女性，应每周做1次宫颈分泌物涂片和培养，连续3次，都是阴性者才能排除。

全世界每年约有600多万人感染此病传统的临床检测方法是使用细菌培养法，但是该方法操作难度大，耗时长，标本运送条件极为严格，并且还存着检出率低的缺点，容易导致漏诊误诊。此外，该方法还需侵入式的获取样本，对患者造成较大的痛苦。常规的PCR检测方法可以避免这一问题，并已有一些利用核酸扩增的方法检测淋病奈瑟氏菌的商业试剂盒，但是常规PCR存在灵敏度低、易污染等缺点，同时常规PCR专利已经失去保护，很难形成商品化试剂盒。

实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。

实时荧光定量PCR技术有很多分支，其定量方式也不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。荧光染料嵌入技术是利用SYBR green I 嵌入DNA双链是荧光强度增加的特性，将荧光信号引入双链DNA，该方法特异性较差，结果常受到引物二聚体的存在的干扰而导致假阳性等问题，因此不适合用于临床，目前国内已有应用自身淬灭荧光技术检测淋病奈瑟菌方法的专利，专利号为200510020234.3，然而该专利设计的引物针对于淋病奈瑟菌隐蔽性质粒（cppB基因GenBank 登录号L40552）为模板，近年研究表明cppB基因在一些淋病奈瑟菌株存在交叉反应以及靶序列在一些淋病奈瑟菌株中缺乏，因此Bruisten等认为cppB基因不宜作为淋病奈瑟氏菌扩增的靶基因。荧光探针技术如Taqman技术、分子信标技术等因为其特异性比荧光染料嵌入技术和自身淬灭荧光技术要好，因此更适合临床使用。。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，它具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一组用于淋病奈瑟氏菌实时荧光PCR检测的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：

上游引物NG16s169F：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’ 

下游引物NG16s235R：5’-GCTAATACCGCATACGTCTTGAGA-3’

探针NG16s210P：5’-FAM-TCGGGCCTTGCGCTATCCGA-TAMRA-3’

其中，所述探针NG16s210P中的FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

上述探针NG16s210P中的荧光报告基团FAM可替换为TET、JOE、HEX或VIC中的一种。