[发明专利]一种利拉鲁肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的制备方法。

背景技术

随着生活水平的提高和生活方式的改变，近年来，我国糖尿病的发病率有逐年增加的趋势。糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等，继而引发体内糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，一旦控制不好会引发严重的并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病分为妊娠期糖尿病、特异性糖尿病、I型糖尿病和II型糖尿病。其中，II型糖尿病又名非胰岛素依赖型糖尿病，特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。

II型糖尿病主要通过口服或皮下注射降糖药治疗。针对II型糖尿病的降糖药种类很多，包括二甲双胍、磺脲类药物和胰高血糖样肽-1（GLP-1）的受体激动素等，GLP-1的受体激动素是近年来研究的热点。其中，利拉鲁肽（liraglutide）是GLP-1的受体激动素之一，2010年1月25日，美国FDA批准由丹麦诺和诺德公司研发的利拉鲁肽（商品名为Victoza）注射剂在美国上市，2011年3月4日，利拉鲁肽获得SFDA批准上市。利拉鲁肽的化学表述为Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu-(N-hexadecanoyl))]-GLP-1^7-37，分子式为C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，相对分子质量3751.2，CAS登记号为204656-20-2，分子式如式I所示，与天然GLP-1相比，药效相当且作用时间更长。

             式I

目前，诺和诺德公司主要是通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽；有报道利用固液合成法合成利拉鲁肽，其中间体GLP-1(7-37)-OH均需要经过反相HPLC纯化，再在液相条件下与Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，纯化得到利拉鲁肽；有报道利用一种固液法合成其类似物的方法，基本原理是采用固相法合成GLP-1(7-37)-OH，再在液相条件下用NMP和水溶解，加入碱（DIPEA），再加入Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu，反应结束后加入甘氨酸终止反应，再经过RP-HPLC纯化得到目标产物；还有报道利用一种全固相合成方法，采用2-CTC树脂或王树脂，按照利拉鲁肽肽序逐个偶联氨基酸，最后经过反向纯化得到利拉鲁肽，或者是采用5个片段偶联的方法合成利拉鲁肽。

由于利拉鲁肽的肽序较长，其中含有15个疏水性氨基酸，而在Fmoc固相合成中，疏水性氨基酸的存在会导致肽链的β折叠，导致氨基酸偶联效率低下，从而产生缺省肽（非目的肽），在纯化过程中难以纯化，导致利拉鲁肽的收率偏低。另外，现有的合成方法合成利拉鲁肽时，在脱除赖氨酸侧链的步骤中用到了昂贵的钯催化剂，使得合成成本偏高。因此，提供一种产品收率高、成本低廉的利拉鲁肽制备方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利拉鲁肽的制备方法。该方法制得的利拉鲁肽中杂质少，易纯化，可提高最终产品的收率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利拉鲁肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤A：取Gly与树脂偶联，得到Gly-树脂；

步骤B：取Gly-树脂经第一逐步偶联，得到多肽片段-树脂；

步骤C：取多肽片段-树脂经侧链修饰、第二逐步偶联、裂解、纯化、冻干，即得；

多肽片段-树脂中多肽片段的序列如SEQ ID NO：1所示；

利拉鲁肽的序列如SEQ ID NO：2所示；

侧链修饰具体为：脱除多肽片段-树脂中Lys侧链的保护基，依次偶联Fmoc-Glu-OtBu、棕榈酰氯。

作为优选，步骤A中树脂为CLEAR-Acid Resin。

作为优选，树脂的替代度为0.2～1.0mmol/g；

作为优选，Gly-树脂的替代度为0.15～0.32mmol/g。

作为优选，从N端起，利拉鲁肽第11位、第12位的氨基酸原料为Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH。