[发明专利]一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种利用膜分离技术，尤其是一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法。

背景技术

乳酸片球菌素PA-1（Pediocin PA-1）是由44个氨基酸组成的具有抗菌活性的小肽，其等电点为9.6，理论分子量为4624Da。乳酸片球菌素PA-1最早是在乳酸片球菌PAC1.0中发现的，并因此被冠名。随着研究的不断深入，发现除了乳酸片球菌外，乳酸菌的其它属、种微生物，如植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和小片球菌（Pediococcus parvulus）也能产生乳酸片球菌素PA-1。

乳酸片球菌素PA-1的抑菌范围为亲缘关系相近的乳酸菌和部分非乳酸菌的革兰氏阳性细菌，尤其对食品中常见致病菌和腐败菌，如单细胞增多症李氏杆菌和梭状芽孢杆菌有很好的抑菌效果。此外，乳酸片球菌素PA-1具有较好的耐热、耐酸、耐有机溶剂等特性，这些特性证明了乳酸片球菌素PA-1具有很好的食品防腐剂的开发潜力。

目前，对乳酸片球菌素PA-1的提取纯化方法报道的很多，与普通的蛋白纯化类似，多为细菌素的浓缩结合各级色谱纯化，这些方法适合实验室小规模纯化，可以达到理想的纯度，但步骤繁琐，收率损失较大，而且费时费力。2008年，Naghmouchi等人首次报道了亲和色谱一步纯化乳酸片球菌素PA-1，这种方法简单、快速、特异性强，重复性好，但亲和色谱填料成本昂贵，再生困难。

从科学研究的角度分析，我们需要大量的（毫克级）高纯度的乳酸片球菌素PA-1进行更为深入的生化结构解析和构效研究；从应用的角度分析，我们需要大量的（克级）、不用很高纯度的细菌素产品来直接应用。无论如何，现有的盐析结合各级色谱纯化的方法都过于繁琐，大量纯化成本也太高；因此，开发更为简便，更有实际应用价值的工业化级别的纯化方法很有必要。

膜分离技术兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，是当今循环经济时代最受瞩目的一项高新技术，膜分离技术的出现，为工业化规模纯化细菌素提供了新的、可行的思路，利用膜分离技术从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法，本方法利用膜分离技术，具有操作简单、耗能少、污染小、成本低、易于工业化生产和适用于多种后续纯化方法等诸多优点。

本发明实现目的的技术方案是：

一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法，步骤如下：

⑴发酵液预处理

取含乳酸片球菌素PA-1的发酵液，60-80℃恒温水浴处理30-60分钟，冷却至20-30℃，用浓盐酸调节pH至2.0-3.0，搅拌，释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中；

⑵板框过滤

在发酵液中加入0.5-1.2%的助滤剂，搅拌，进行板框过滤，弃去滤饼，收集滤液；

⑶微滤除杂

将板框过滤后的滤液在温度25-35℃，压力为1.0-1.5MPa下通过金属氧化膜或陶瓷膜过滤，膜的孔径为5μm，微滤至体积浓缩比3-6倍时，开始洗滤，洗滤液的体积和浓缩液体积相同，最终使浓缩液为初始进料液体积的4-7%，渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液；

⑷超滤除杂

步骤⑶得到的渗透液在温度20-30℃，压力为0.05-0.1MPa下，通过截留分子量为10000-30000道尔顿的超滤膜，超滤至体积浓缩比为4-6时，加入和浓缩液等量的水进行洗滤，至最终浓缩液为料液体积的4-10%为止，收集滤液；

⑸超滤除杂浓缩

步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000-3000道尔顿的超滤膜过滤，超滤操作温度20-30℃，压力为0.05-0.1MPa，超滤至体积浓缩比为8-12时为止，收集浓缩液；

⑹喷雾干燥

步骤⑸得到的浓缩液，加入填料固体食盐，在喷雾干燥机进行干燥，进口温度为120-170℃，出口温度为70-90℃，使喷雾干燥后含盐量为25-35%，喷雾干燥，即得乳酸片球菌素PA-1；

而且，所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩。

而且，所述超滤膜为中空纤维膜。

而且，所述步骤⑸超滤除杂浓缩后经过如下步骤，获得乳酸片球菌素PA-1的白色粉末：

⑺C18制备色谱纯化

步骤⑸得到的浓缩液，经反相C18制备色谱纯化，收集保留时间15.0-15.4分钟的蛋白峰为乳酸片球菌素PA-1活性峰；

⑻冷冻干燥