[发明专利]一种肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）肌酸激酶同功酶校准品，浓度为0，3，15，50，200，800ng/mL；

2）偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；

3）生物素标记的肌酸激酶同功酶抗体，所述抗体为单克隆抗体；

4）肌酸激酶同功酶抗体酶结合物，所述抗体为单克隆抗体，与生物素标记的肌酸激酶同功酶抗体不为同一株，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；

5）肌酸激酶同功酶质控品；质控品包括浓度12ng/mL的低值质控品和300ng/mL的高值质控品；

6）化学发光液A液和B液；A液为5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.165g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；

7）20倍浓缩洗液；

8）反应管。

2.根据权利要求1所述的肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

3.根据权利要求1所述的肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

4.一种制备所述权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）肌酸激酶同功酶校准品的配制：

将肌酸激酶同功酶抗原用校准品稀释液，所述校准品稀释液是用含1%BSA的磷酸盐缓冲液配制成校准品浓储液，以企业标准品进行定标，将浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，3，15，50，200，800ng/mL；

（2）肌酸激酶同功酶质控品的配制：

用人血清将肌酸激酶同功酶抗原稀释配制成浓储液，并以企业校准品进行定标，将浓储液用人血清稀释至12ng/mL和300ng/mL；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇，搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入过氧化苯甲酰，用量为磁流体用量的3%，搅拌速度约为500rpm，苯乙烯体积同磁流体溶液，丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4，保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h，所得产物静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复洗涤，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的肌酸激酶同功酶抗体的制备

取0.6mg肌酸激酶同功酶抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入32ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5-10%，缓慢振荡，避光反应2.5h；在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01M PBS溶液在2～8℃下透析24h，期间换液2-4次；

（5）肌酸激酶同功酶抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将肌酸激酶同功酶抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入10%酶稳定剂，储存于2～8℃；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃，每种试剂各一瓶；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。