[发明专利]一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用

说明书

本发明公开了一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。该亲本质粒是在出发载体pEGFP‑N1‑attB质粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表达盒构建而成，所述attR片段插入出发载体限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位点之间，所述attL片段插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位点之间，所述ΦC31整合酶基因表达盒插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ的酶切位点。利用该亲本质粒能够快速、高效、经济地获得用于稳定整合的微环DNA，后续的转基因操作方法简单易行，具有重要的生物学意义及实际应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。

背景技术

微环DNA载体（Minicircle DNA Vector）是一种超螺旋的DNA分子，它是亲本质粒（Parental Plasmid,PP）发生位点特异性重组的产物。在重组酶的作用下，亲本质粒转变为两个环状DNA，一个含有大量的细菌骨架序列，称为微质粒（Miniplasmid,MP）；另一个则是仅含有目的基因的真核表达框架，即微环DNA（Minicircle,MC）。与传统质粒载体相比，微环DNA作为载体具有安全性好、携带的目的基因表达水平高、转基因表达持续时间长等优点（Darquet AM,Cameron B,Wils P,et al.A new DNA vehicle for nonviral genedelivery:supercoiled minicircle.Gene Ther,1997,4:1341-1319.Chen ZY,He CY,Ehrhardt A,et al.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result inpersistent and high-level transgene expression in vivo.Mol Ther,2003,8:495-500.Bigger BW,Tolmachov O,Collombet JM,et al.An araC-controlled bacterial creexpression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear andmitochondrial gene therapy.J Biol Chem,2001,276:23018-23027.）。

已有报道利用LR克隆酶(Invitrogen,Cat.No.11791-020)成功获得微环DNA载体（Tasic B,Hippenmeyer S,Wang C,et al.Site-specific integrase-mediatedtransgenesis in mice via pronuclear injection.Pro Natl Acad Sci U S A,2011,108(19):7902-7907）。上述报道方法为：构建亲本质粒时连入attL和attR片段，在体外LR克隆酶的作用下attL和attR片段发生重组，生成微质粒和微环DNA，微质粒在限制性内切酶作用下被破坏，最后通过切胶回收获得微环DNA，然而该方法存在如下缺点：1、LR克隆酶价格昂贵，200μl体系用量大，成本较高；2、微环DNA经过胶回收纯化得到，损失大，获得量少；3、步骤繁琐，LR反应后还要进行限制性酶切将微载体破坏，造成后续微环DNA纯化回收的困难。因此很有必要对如何高效、快速、经济地利用LR克隆酶获得微环DNA载体的方法进行研究。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前利用LR克隆酶获得微环DNA的步骤较繁琐以及微环DNA获得量较低的缺陷，提供一种获得微环DNA的亲本质粒及其转基因的方法和应用，利用本发明所述的亲本质粒可以高效、快速、经济地得到微环DNA，并且高效、快速地获得转基因细胞株。