[发明专利]痘苗病毒的GFP示踪系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种痘苗病毒的GFP示踪系统及其应用，特别涉及一种在野生型痘苗病毒WR株基因组中插入GFP编码基因后得到的重组痘苗病毒。

背景技术

痘苗病毒（vaccinia virus）属痘病毒（Poxvirus）。在血清学和免疫学上与天花病毒及牛痘病毒有密切关系，被用作天花预防疫苗的抗原。病毒粒子体积约300×230×100纳米，呈椭圆砖形，含有分子量160～170×10⁶的DNA。人接种时，一般在皮肤出现局部病变，但免疫系统有缺陷时则侵犯到全身（全身性痘疱，vaccina generalisata，又称进行性种痘后湿疹），往往致死，较罕见的则出现种痘后脑炎。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是来源于发光水母（aequorea victoria）的一种功能独特的蛋白质，分子量为27kD，由238个氨基酸组成。自1992年Prasher等克隆到GFP的cDNA以来，GFP示踪技术已广泛应用于分子生物学研究领域。结合GFP荧光示踪的技术手段，可分别在细胞和动物水平，对标记分子或物质进行荧光示踪监测和定量检测。

目前尚未有对痘苗病毒进行GFP示踪的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种痘苗病毒的GFP示踪系统及其应用。所述痘苗病毒的GFP示踪系统即为一种表达绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒。

本发明所提供的重组痘苗病毒，是将野生型痘苗病毒基因组DNA进行替换或插入得到的重组病毒；

所述替换为：将所述野生型痘苗病毒基因组DNA中的片段a中的任一片段（可由1个、2个或更多个核苷酸组成）替换为片段b；

所述插入为：在所述野生型痘苗病毒基因组DNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；

所述片段a为序列表中序列1所示DNA片段；所述片段b为含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段。

所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列2所示。

在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码基因具体为序列表中序列3的第142-861位。

进一步，所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。

在本发明的一个实施例中，所述野生型痘苗病毒具体为野生型痘苗病毒WR株。

进一步，所述野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列为GenBank号为NC_006998.1的序列（Up date：2012-11-22）。

在本发明的一个实施例中，所述重组痘苗病毒是将野生型痘苗病毒基因组DNA进行插入外源基因得到的重组病毒；具体的，所述插入中，所述“片段a中的任一位点处”为所述片段a中的序列1的第459位和第460位之间的位置。

由于所述野生型痘苗病毒的基因组DNA序列为GenBank号为NC_006998.1的序列（Up date：2012-11-22），相应的，所述重组痘苗病毒的基因组DNA序列为在GenBank号为NC_006998.1的序列（Up date：2012-11-22），的第80725位和第80726位之间插入序列表中序列3后得到的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组痘苗病毒的方法。

本发明所提供的制备所述重组痘苗病毒的方法，可包括如下步骤：

（a）将所述野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；

（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体甲；

（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；