[发明专利]痘苗病毒的GFP示踪系统及其应用

权利要求书

1.重组痘苗病毒，是将野生型痘苗病毒基因组DNA进行替换或插入得到的重组病毒；

所述替换为：将所述野生型痘苗病毒基因组DNA中的片段a中的任一片段替换为片段b；

所述插入为：在所述野生型痘苗病毒基因组DNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；

所述片段a为序列表中序列1所示DNA片段；所述片段b为含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.根据权利要求2所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列3的第142-861位。

4.根据权利要求1-3中任一所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。

5.根据权利要求1-4中任一所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述野生型痘苗病毒为野生型痘苗病毒WR株；或

所述插入中，所述片段a中的任一位点处为所述片段a中的序列1的第459位和第460位之间的位置。

6.根据权利要求5所述的重组痘苗病毒，其特征在于：所述重组痘苗病毒的基因组DNA的序列为在GenBank号为NC_006998.1的序列的第80725位和第80726位之间插入序列表中序列3后得到核苷酸序列。

7.制备权利要求1-6中任一所述重组痘苗病毒的方法，包括如下步骤：

（a）将权利要求1-5任一中所述的野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；

（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体甲；

（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为权利要求1-4任一中所述的含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；

（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体甲感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体甲与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体甲中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙，所述重组痘苗病毒载体乙即为权利要求1-6中任一所述重组痘苗病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法的步骤（a）中，位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_006998.1的序列的第80267-80725位和第80726-81194位的序列。

9.权利要求1-6中任一所述重组痘苗病毒在如下（a1）或（a2）中的应用：

（a1）制备研究痘苗病毒感染机制的产品；

（a2）制备筛选抗痘苗病毒药物的细胞模型。

10.如下（b1）或（b2）的生物材料：

（b1）含有权利要求1-6中任一所述重组痘苗病毒的离体动物细胞或重组菌；

（b2）含有权利要求1-6中任一所述重组痘苗病毒的基因组RNA或cDNA的载体。