[发明专利]容器内的计数对象物的计数方法及计数用装置

说明书

本申请是申请人于2010年3月2日提出的国际申请号为PCT/JP2010/001414(中国国家阶段申请号：201080011026.6)、发明名称为“细胞培养方法、细胞培养装置、容器内的计数对象物的计数方法及计数用装置”的国际申请的分案。

技术领域

本发明涉及用于培养细胞、组织、微生物等的细胞的细胞培养方法、细胞培养装置以及容器内的计数对象物的计数方法、计数用装置。

背景技术

近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工的环境下高效、大量地培养细胞、组织、微生物等。

在这种细胞的大量培养中，特别是在培养悬浮细胞时，通常使用具备搅拌翼的培养槽的搅拌培养是较为普遍的。但是，特别是在容易受到外力损伤的细胞或者边形成凝聚块边增殖的细胞的情况下，广泛应用不使用搅拌翼而将细胞封入培养容器中，静置(细胞沉到底面的状态下)，进行培养，随着细胞的增殖，转移到底面积较大的容器中或者增加容器个数的方法。但是，在该静置培养中，存在当细胞凝聚块随着细胞的增殖而增大时，对各细胞的氧气和营养成分的供给逐渐变得不足，增殖效率下降的问题。

另外，在转移容器时，虽然会先搅拌培养液而使氧气和营养成分的不均消除，但是，存在因每次转移操作时对细胞产生的损伤而使增殖效率下降的问题。

另一方面，也广泛进行时常对培养容器进行搅拌的振荡培养。

例如，根据专利文献1中所述的细胞培养装置，能够以旋转、振荡等各种模式使装载培养容器的台运动，从而能够对培养容器内的培养液进行搅拌。

另外，专利文献2和专利文献3中所述的细胞培养装置采用如下机制：使培养容器内的液体培养基以不产生气泡的方式进行振荡，通过波动供给氧以使细胞不产生损伤。

通过这些细胞培养装置的振荡方法，整个培养基被剧烈地搅拌，因此细胞各自零散地分离，氧气和营养成分扩散到整体，能够充分地供给到各细胞。

另外，在这样的细胞培养中，需要配合细胞的增殖将培养液中的细胞的密度维持在适当的范围内。

即，培养液中的细胞密度过大时，不能供给各细胞充分的氧气和营养，细胞增殖效率下降。另外，培养液中的细胞密度过小也得不到充分的增殖效率。

因此，在细胞培养时，为了在培养中把握细胞密度，需要适当计测培养容器内的培养液中的细胞数。

例如，专利文献4中公开了能够配合细胞的增殖适当维持培养液中的细胞密度的细胞培养装置。

在使用这样的细胞培养装置进行细胞数的计测时，以往采用如下方法：从与培养容器内相连的取样用口中采集含有培养细胞的培养液，加入规定的缓冲液调节至适于测定培养液中的细胞的密度后，注入计数板中，通过人工或机械读取其数量，从而计算细胞密度。

另外，专利文献5中公开了具备拍摄单元的培养装置。根据该培养装置，能够定期获取细胞图像并保存。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第5057429号公报

专利文献2：国际公开2000/66706号小册子

专利文献3：日本特表2007-511231号公报

专利文献4：国际公开2008/136371号小册子

专利文献5：国际公开2007/052718号小册子

发明内容

但是，根据细胞种类的不同，细胞的增殖有时在细胞单个分散的状态下难以进行，当各个细胞发生粘附而形成适当尺寸的凝聚块时，增殖效率提高。具体而言，除了神经干细胞、胚胎干细胞、肝细胞、角膜干细胞、胰岛细胞等贴壁细胞之外，还可以举出血细胞等悬浮细胞。

在这样的细胞的情况下，在以往的静置培养中，每次转移时会剧烈地搅拌培养容器，因此，此时细胞单个分散，存在所谓细胞的增殖效率下降的问题。

另外，在利用专利文献1～3中所述的细胞培养装置等进行振荡培养的情况下，也同样对培养基整体进行剧烈的搅拌，成为细胞在培养基中分散悬浮的状态，因此，细胞难以形成适当尺寸的凝聚块，存在难以使细胞的增殖效率最佳化的问题。

另外，在使用专利文献4中所述的细胞培养装置来计数培养液中的细胞的情况下，需要从培养容器内采集培养液，从而使培养体系开放，因此，存在混入杂菌等污染的风险。

另外，根据专利文献5中所述的培养装置，虽然可以获取细胞图像，但是难以根据该图像准确地计测细胞数并得到细胞密度。

即，利用专利文献5中所述的拍摄单元对培养容器内的细胞进行拍摄时，通过计测细胞图像的细胞数并用该细胞数除以该拍摄单元的视野内的培养液的容积，可以计算细胞密度。