[发明专利]一种细胞培养用GF微载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，涉及一种细胞培养用微载体。

背景技术

动物细胞生物反应器微载体培养技术是当前生物制药行业贴壁依赖性细胞培养的领先技术。微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、透明的小颗粒。能使贴壁依赖性细胞贴附在颗粒表面进行悬浮培养，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。

自1967年Van Wezel第一个用DEAE-Sephadex A 50作为贴壁细胞培养用微载体以来，研究报道的细胞培养用微载体已有十多种，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳质微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。我国目前使用的商品化微载体主要有：如GE公司的CytodexⅠ、Cytodex Ⅱ、Cytodex Ⅲ和Thermo 公司的Cytopore，Cytoline，Biosilon、Cultispher G等，均为进口产品，价格昂贵，目前的市场价已达每公斤3-10万元人民币，还时常出现供货不及时的现象，而国产微载体大多数尚在研制之中，或生产规模小，不能满足我国生物制药领域疫苗、重组药物蛋白、单克隆抗体、细胞因子及其受体等医用生物制品生产的需要，是限制我国动物细胞培养技术从转瓶细胞培养工艺向生物反应器微载体培养工艺转型的技术瓶颈之一。 

目前，在发达国家，生物制药行业贴壁依赖型动物细胞培养工艺已普遍采用生物反应器微载体培养工艺，几千升、上万升的动物细胞培养生物反应器已用于抗体或人用及兽用疫苗的生产，微载体细胞培养的规模已达到6000L以上。而我国绝大多数疫苗类制药企业仍然沿用传统的转瓶（滚瓶）培养工艺。该工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批间差异大，且容易造成污染，耗时耗力，导致我国绝大多数制药企业的生物医药产品生产成本高，产值低，无法与国外产品竞争。要提高产品竞争力，只有采用生物反应器微载体大规模培养技术。

因此，开发适合于我国生物医药领域多种动物细胞培养用的具有自主知识产权的国产微载体，具有广泛的应用前景，对促进我国生物反应器微载体大规模细胞培养技术的发展具有重要的历史意义。

利用胶原蛋白制备微载体首先是1985年由Verax公司开创的Verax系列多孔胶原微载体，由于不能高压灭菌，只能采用γ射线灭菌，限制了Verax系列多孔胶原微载体的使用。1986年Nilsson首先报道了大孔明胶微载体的制备及在细胞培养中的应用，利用Span、甲苯和加有Tween的明胶制备大孔明胶微载体，但所用的明胶（即基质）浓度较低。使得微载体收率低，价格昂贵（每公斤超过10万元人民币）。1997年华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室张孝兵等在Nilsson的方法基础上，经过改进，使明胶浓度达到2.5-10%，制备了大孔明胶微载体（但未见产品上市）；目前市场上商品化的明胶制备的生物可降解微载体有Gultispher G 和Gultispher S，二者都具有孔隙，为多孔微载体；Cytodex3是猪明胶包被葡聚糖为材质可高压灭菌的实心微载体，适用于多种较难培养的动物细胞，但其使用前需要对细胞培养容器进行预先硅化，并且价格昂贵，每公斤3～10万元人民币。Cellagen是牛Ⅰ型胶原交联而成。2004年南京工业大学黄任远等以天然胶原蛋白为原料，采用铬、甲醛、戊二醛改性试剂及铬、戊二醛、铝-植物单宁复合改性试剂，制备动物细胞培养用微载体，并进行了CHO细胞培养研究，但载体制备规模小，适宜的细胞少（未见产品上市）；。2004年中国科学院动物研究所发明了壳聚糖-明胶实心和多孔微载体，适合于大规模生产（有专利：CN1641017A, 未见产品上市），但其是用壳聚糖酸溶液和明胶按照一定比例混合后，在加有一定Span的矿物油中制成，在戊二醛交联固定后，用甘氨酸封闭多余的醛基，再用氢氧化钠中和醋酸等工艺制成，工艺相对复杂，所用基质材料为壳聚糖和明胶，由于是两种基质，其实心微载体与传统实心微载体一样，在培养后期，细胞容易从载体上脱落，不适合于细胞在低血清和无血清培养基中长期培养。

发明内容

本发明提供了一种细胞培养用GF微载体，为此，本发明还提供该微载体的制备方法。本发明的微载体具有下述特点：采用单纯的变性胶原或明胶基质，利用微球制备技术在乳化成球、戊二醛交联固定后，以硼还原剂脱色还原，中和了戊二醛的毒性，提高了变性胶原的收缩温度，胶原基质浓度高、生物相容性好、可以采用高压灭菌、使用前不需对细胞培养容器进行预先硅化、工艺简单、价格低廉、适合多种细胞培养，在培养后期，细胞不容易脱落，适宜于在低血清和无血清培养基中培养贴壁细胞。